一种钾离子通道蛋白kc1-d及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种钾离子通道蛋白KC1-D及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 钾是植物细胞中最丰富的阳离子之一，也是植物生长所必需的三大营养元素之 一。钾在植物活细胞的诸多方面，如渗透势调节、电荷平衡、糖类转运、蛋白质合成以及细胞 中多种酶活力的调控方面，都起到了不可替代的作用。钾在植物生长发育中发挥着重要作 用，它参与了植物的诸多生理、生化代谢过程，对植物的正常生长发育及产量获得等具有重 要影响。
[0003] 我国作为农业大国，大部分耕地土壤呈现缺钾态势。然而我国钾矿储量低，钾肥严 重匮乏，大约一半以上依赖进口。因而钾肥资源的匮乏已成为限制我国农业生产发展的重 要因素之一。尽管提高钾肥施用量可以大幅度地提高作物产量，但大量进口钾肥无论从经 济上还是从长远的战略意义上考虑，都有一定的局限性。因此，了解和认识植物对低钾胁迫 的反应机制，挖掘能够提高农作物耐低钾能力的关键基因或优良等位变异，已成为提高农 作物钾营养利用效率和粮食产量的重要研究工作。
[0004] 针对我国土壤缺钾且钾肥资源极其匮乏这一问题，克隆植物耐低钾基因并对其功 能进行研究，进而通过基因工程、同源基因等位变异、作物分子改良等方法获得钾营养高效 的品种，对于培育耐低钾植物/作物品种有重要的实践意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种钾离子通道蛋白KC1-D及其编码基因和应用。
[0006] 本发明提供的蛋白质，获自拟南芥，命名为KC1-D蛋白，是如下(a)或(b):
[0007] (a)由序列表中序列1所不的氣基酸序列组成的蛋白质；
[0008] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与植物对低钾环境的耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0009] 为了使(a)中的KC1-D蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸 序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0010] 表1标签的序列
[0013] 上述(b)中的KC1-D蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 到。上述(b)中的KC1-D蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个 或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/ 或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0014] 编码所述KC1-D蛋白的基因(KC1-D基因）也属于本发明的保护范围。
[0015]所述基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0016] 1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物对低钾环境的耐逆性相关 蛋白的DNA分子；
[0018] 3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与植物对低钾环境的耐逆 性相关蛋白的DNA分子。
[0019] 上述严格条件可为用〇 · 1 X SSPE(或0 · 1 X SSC)，0 · 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA杂 交实验中65°C下杂交并洗膜。
[0020] 含有所述KC1-D基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发 明的保护范围。
[0021 ]可用现有的植物表达载体构建含有KC1-D基因的重组表达载体。所述植物表达载 体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用KC1-D基因构建重组表达载 体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动 子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用KC1-D基因构建重组表达 载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始 密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正 确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成 的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物 进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化 的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基 因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0022] 所述重组表达载体具体可为在Superl300载体的多克隆位点插入所述KC1-D基因 得到的重组质粒。所述重组表达载体更具体可为将Sup erl300载体Xbal和SacI之间的小片 段取代为序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
[0023] 本发明还保护所述KC1-D蛋白的应用，为如下（cl)至(c6)中的至少一种：
[0024] (cl)调控植物的钾离子吸收能力；
[0025] (c2)促进植物的钾离子吸收能力增加；
[0026] (c3)调控植物的钾离子吸收速率；
[0027] (c4)促进植物的钾离子吸收增加；
[0028] (c5)调控植物对低钾环境的耐逆性；
[0029] (c6)增加植物对低钾环境的耐逆性。
[0030]所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如kcl 突变株拟南芥。
[0031]本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述KC1-D基因导入目的植物中， 得到转基因植物;所述转基因植物满足如下(dl)至(d3)中的至少一种表型：
[0032] (dl)钾离子吸收能力高于所述目的植物；
[0033] (d2)钾离子吸收速率高于所述目的植物；
[0034] (d3)对低钾环境的耐逆性高于所述目的植物。
[0035] 携带有所述KC1-D基因的重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直 接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
[0036] 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例 如kcl突变株拟南芥。
[0037] 本发明还保护所述KC1-D蛋白、所述KC1-D基因、所述重组表达载体、所述表达盒、 所述转基因细胞系、所述重组菌或以上任一所述方法在植物育种中的应用。
[0038] 所述育种的目的为培育钾离子吸收能力高和/或钾离子吸收速率高和/或对低钾 环境的耐逆性高的植物。
[0039]所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如kcl 突变株拟南芥。
[0040] 以上任一所述低钾具体可为钾浓度为100μΜ。
[0041] 本发明中，通过试验证实了将KC1-D基因在目的植物中表达后，可以增加植物对低 钾环境的耐受能力，增加植物对钾离子的吸收能力和吸收速度。本发明对培育耐低钾新品 种，以及植物对低钾耐受的研究具有重要意义。本发明在作物分子改良中具有较大应用价 值，对于培育耐受低钾胁迫的作物具有重要的理论意义和实践意义。
【附图说明】
[0042]图1为表型观察的照片。
[0043]图2为钾离子含量检测的结果。
[0044]图3为钾离子吸收速率检测的结果。
【具体实施方式】
[0045]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0046] Superl300载体:购自上海北诺生物科技有限公司，货号为addgene 0595。
[0047] 农杆菌菌株GV3101:Clough SJ,Bent AF(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16:735-743。
[0048] 哥伦比亚生态型拟南芥，用Col表示。
[0049] 从ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)购买编号为SALK_140579的 T-DNA插入突变体(插入位置位于KC1基因中），将其命名为kcl突变株拟南芥。经测序，kcl突 变株拟南芥为纯合突变株，T-DNA取代了序列表的序列4第1505至1529位核苷酸之间的小片 段，从而敲除了 KC1基因全长的表达。
[0050] MS液体培养基（ρΗ5·8):每升含 1650mg NH4N03，1900mg KN03,370mg MgS〇4 · 7H20， 170mg KH2P〇4,440mg CaCl2 · 2H20,22.3mg MnS〇4 · 4H20,0.83mg KI，0.025mg CuS〇4 · 5H20， 6.25mg H3B〇5,0.025mg CoCl · 6H2〇,8.65mg ZnSCU · 7H2〇,0.25mg Na2Mo〇4 · 2H2〇,27.8mg FeS〇4 · 7H20和37.3mg Na2-EDTA，用电阻大于18ΜΩ的双蒸水定容至1LJS培养基中钾浓度 为20.7II1MJS固体培养基:在MS液体培养基的基础上，每升加入30g蔗糖、9g琼脂粉。
[0051 ] LK液体培养基（ρΗ5·8):每升含2300mg/L NH4N03,370mg/L MgS〇4 · 7H20，144mg/L NH4H2P〇4,440mg/L CaCl2 · 2H20,22.3mg MnS〇4 · 4H20,0.83mg KI，0.025mg CuS〇4 · 5H20， 6.25mg H3B〇5,0.025mg CoCl · 6H2〇,8.65mg ZnSCU · 7H2〇,0.25mg Na2Mo〇4 · 2H2〇,27.8mg FeS〇4 · 7H20和37.3mg Na2-EDTA，用电阻大于18ΜΩ的双蒸水定容至ll^LK培养基中钾浓度 为100μΜΙΚ固体培养基:在LK液体培养基的基础上，每升加入30g蔗糖、9g琼脂粉。
[0052] 1/4MS液体培养基:各个溶质的含量均为MS液体培养基的四分之一。
[0053] 1/4LK液体培养基:各个溶质的含量均为LK液体培养基的四分之一。
[0054] LK1培养基:KC1的浓度为250μΜ，其它溶质的含量均为LK液体培养基的四分之一。
[0055] 实施例1、KC1_D蛋白及其编码基因的获得
[0056] 通过对EMS随机诱变的数十万株哥伦比亚生态型拟南芥幼苗进行低钾胁迫筛选， 获得的具有耐低钾性状的突变体。经测序发现，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，该突变体在 某一开放阅读框中发生了一个SNP突变（由G突变为A)。突变体中的相应开放阅读框如序列 表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。哥伦比亚生态型拟南芥中的相应开放 阅读框如序列表的序列4所示，编码序列表的序列3所示的蛋白质。
[0057] 与序列3相比，序列1的差异仅在于将序列3中的第322位氨基酸残基由甘氨酸突变 为了天冬氨酸。与序列4相比，序列2的差异仅在于将序列4中的第965位核苷酸由G突变为了 A〇
[005