一种具有癌细胞选择性杀伤和迁移抑制作用的多肽分子及其设计方法与用图

文档序号:9761914
一种具有癌细胞选择性杀伤和迁移抑制作用的多肽分子及其设计方法与用图
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术制药应用领域。尤其是涉及多肽分子作为先导药物分子的技 术领域。
【背景技术】
[0002] 癌症严重危害人类生命与健康,全世界每年约有1300万新增癌症患者,我国肿瘤 登记中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》显示,中国每年新发肿瘤病例约为312万例,因癌 症死亡的病例达270万例,包括肝癌在内的恶性肿瘤已成为人类疾病死亡的头号杀手。抗癌 药物的研发已成为医药和生命科学工作者研究的重点。
[0003] 目前,绝大多数抗癌化疗药物存在癌细胞选择性差、毒副作用较大等局限,以肿瘤 密切相关和过表达的蛋白为靶标进行靶向药物研究是抗癌药物开发的重要方向。在肿瘤密 切相关的各类重要革标蛋白中,叉头盒(Fork head box,Fox)转录因子FoxMl在肿瘤的发 生、发展和侵袭、转移中起着重要的作用,FoxMl被认为是癌症的致命伤(Achilles'heel), 是抗癌药物干预与发现的重要靶标。
[0004]以组学研究、生物芯片、下一代测序等为代表的生命科学的快速发展,为现代创新 药物研发提供了海量的数据,包括癌症在内的多种疾病的药物研发也从压倒优势的化学药 物逐步转向更具吸引力的分子靶向药物。小分子多肽作为小分子药物的重要组成部分,在 抗癌药物研发上与治疗性抗体药物一样具有重要的研究价值。目前,已超过60种多肽药物 或诊断试剂获批在美国和其它国家临床使用。申请人前期在国内外首次报道FoxMlc的DNA 结合结构域(DNA binding domain,FoxMlc-DBD)蛋白的原核细菌重组表达、纯化,并以此表 达蛋白为靶标,开展了噬菌体随机十二肽库的高通量筛选,共获得十八条不同的多肽序列, 在此基础上确定了六组模体序列,并发现其中两条模体序列对乳腺癌细胞具有一定的抑制 作用(Jian Cui , Jiaming Huang,Tai 1 in Guo , et al. Expression and Selection of Human Foxmlc Binding Peptides and Their Inhibitions on MCF7 Cancer Cells, International Journal of Peptide Research and Therapeutics,2014,20(4):447-456)。本发明针对目前绝大多数抗癌化疗药物存在癌细胞选择性差、毒副作用较大等局限, 我们有理由相信,基于重要靶标的靶向多肽药物研发在抗癌药物开发中有着重要的作用与 前景,而FoxMl正是抗癌多肽药物筛选与发现的理想靶标。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种具有癌细胞选择性杀伤作用的多肽分子及其设计方法, 它能有效地杀伤癌细胞,并对肝癌、人脐静脉内皮细胞的迀移具有抑制作用。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种具有癌细胞选择性杀伤作用的多肽分子的用途, 它可以用于制备具有杀伤癌细胞和抑制肝癌细胞、人脐静脉内皮细胞迀移的靶向先导药 物。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:在来源于肿瘤密切相关转录因子 FoxMlc的DNA结合结构域蛋白(FoxMlc-DBD)的噬菌体随机十二肽库高通量筛选所获得的多 肽(SEQ ID No: 1,简称P201)的基础上,多肽序列限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者 添加一个或几个氨基酸改造的多肽分子。具体做法是通过在SEQ ID No: 1的N-端添加9个或 8个D-型精氨酸以及二聚甘氨酸丝氨酸,形成具有25个或者24个氨基酸的多肽序列。所述改 造的多肽分子是在多肽SEQ ID No: 1的基础上,通过其N-端添加 D-型精氨酸9个或8个D-型 精氨酸以及二聚甘氨酸丝氨酸,形成N-端含有多聚-D型精氨酸的多肽序列。
[0008] 其中,一种具有癌细胞选择性杀伤和抑制作用的多肽分子,通过在多肽SEQ ID No:l的N-端添加9个D-型精氨酸以及二聚甘氨酸丝氨酸,形成序列为 RRRRRRRRRGSGSWHLDYPSMWYLD的25个氨基酸的多肽序列。
[0009] 一种具有癌细胞选择性杀伤和抑制作用的多肽分子,通过在多肽SEQ ID No: 1的 N-端添加8个D-型精氨酸以及二聚甘氨酸丝氨酸,形成序列为RRRRRRRRGSGSWHLDYPSMWYLD 的24个氨基酸的多肽序列。
[0010]所述多肽分子可以作为靶向先导药物用于制备具有杀伤肝癌、前列腺癌或乳腺癌 细胞的药物。
[0011] 包括:经9聚或8聚氨基酸以及二聚甘氨酸丝氨酸分别添加和偶联改造设计的多肽 分子9R-P201(SEQ ID No:2)和8R-P201(SEQ ID 如:3)具有对肝癌拖口62、前列腺癌01]145、 乳腺癌MCF7细胞强的杀伤作用。9R-P201处理24hr对肝癌HepG2、前列腺癌DU145的细胞半致 死剂量(IC50)分别为43.6和47.6以 8/1111,而对人肝细胞1^02的1050则为2856以8/1111;人脐静 脉内皮细胞HUVEC的IC50为66.8μg/ml。同样,8R-P201也显示对肝癌细胞、乳腺癌细胞强的 杀伤作用:48hr处理肝癌HepG2细胞的IC50值为25.5μg/ml,48hr处理乳腺癌MCF7细胞的 IC50值为33.7μg/ml;与之对应,8R-P201对正常人胚肾293T细胞的杀伤作用明显低于肝癌 HepG2和乳腺癌MCF7细胞,揭示了减少一个精氨酸的8R-P201多肽也具有较好的癌细胞选择 性。Α0/ΕΒ双染检测显示:与对照相比,经9R-P201或8R-P201处理,染色体固缩和凋亡细胞显 著增加,揭示其促细胞凋亡和细胞杀伤作用。以上结果表明该多肽呈现对肝癌细胞、前列腺 癌、乳腺癌细胞等恶性肿瘤细胞强的杀伤作用,而对正常人肝细胞、胚肾细胞、人脐静脉内 皮细胞则显示较低的杀伤作用,尤其是对肝癌细胞具有强的选择性杀伤作用。该多肽可以 作为先导药物,可直接或经修饰、改造后用于制备具有杀伤和抑制肝癌、前列腺癌或乳腺癌 细胞的创新药物。
[0012] 所述多肽分子可以作为靶向先导药物用于制备具有抑制肝癌细胞、人脐静脉内皮 细胞迀移的药物。
[0013] 包括:细胞划痕和Transwell细胞迀移实验确认,经9R-P201多肽处理,人肝癌 HepG2细胞迀移受到极显著抑制(分别为P〈0.001和P〈0.003),更且,经9R-P201处理的人脐 静脉内皮细胞HUVEC其细胞迀移也受到极显著抑制(P〈0.001),鉴于HUVEC细胞在肿瘤微血 管形成中的重要作用,9R-P201对该细胞的迀移作用抑制预期将双重增加对肿瘤的杀伤和 抑制作用。该多肽可以作为先导药物,可直接或经修饰、改造后用于制备具有抑制肝癌细 胞、人脐静脉内皮细胞迀移的创新药物。
[0014] 目前,绝大多数抗癌化疗药物存在癌细胞选择性差、毒副作用较大等局限,分子靶 向药物研发是现代抗癌药物研究的重要方向。
[0015] 本发明与现有技术相比的优点和效果是:
[0016] 1)本发明多肽分子属于分子靶向先导药物,是针对包括肝癌细胞在内的癌细胞高 表达转录因子FoxMlc靶标筛选获得的高亲和力分子,而FoxMlc已被确认在肿瘤的发生、发 展和侵袭、转移中起着重要的作用,是癌症的致命伤。
[0017] 2)本发明在实验室层面已确认该多肽分子对肝癌、乳腺癌、前列腺癌细胞强的杀 伤作用,对肝癌细胞、人脐静脉内皮细胞强的迀移抑制作用。尤其是对肝癌细胞,与对照相 比,还具有强的选择性杀伤作用,揭示其在抗癌药物,尤其是抗肝癌药物研发上的重要前 景。
[0018] 3)从已有文献报道查询可知,本发明确定的多肽分子是目前国内外通过噬菌体文 库筛选获得的具有极低癌细胞杀伤浓度的多肽分子,其杀伤癌细胞水平(IC50)处于国际先 进水平。
【附图说明】
[0019] 图1完全血清培养CCK-8检测9R-P201对肝癌细胞HepG2的杀伤作用。
[0020]图2无血清培养CCK-8检测9R-P201对肝癌细胞HepG2的杀伤作用。
[00211图3完全血清培养CCK-8检测9R-P201对DU145人前列腺癌细胞的影响。
[0022] 图4完全血清培养CCK-8检测9R-P201对HUVEC的杀伤作用。
[0023] 图5完全血清培养CCK-8检测9R-P201对L-02肝细胞的影响。
[0024]图6完全血清培养MTT检测8R-P201对HepG2人肝癌细胞的杀伤作用。
[0025]图7完全血清培养MTT检测8R-P201对MCF7人乳腺癌细胞的杀伤作用。
[0026]图8细胞划痕检测9R-P201处理对人肝癌HepG2细胞迀移的影响。
[0027] 图9细胞划痕检测9R-P201处理对人HUVEC细胞迀移的影响。
[0028] 图10 Transwell检测9R-P201处理对人HepG2细胞迀移的抑制作用。
【具体实施方式】
[0029]本发明针对十二肽氨基酸序列(SEQ ID No: 1,多肽简称为P201)进行9聚D-型精氨 酸或8聚D-型精氨酸的改造设计,进而深入开展其对肝癌、前列腺癌、乳腺癌等癌细胞株的 杀伤及选择性杀伤和迀移抑制作用研究。下面结合实施例,对本发明作进一步的描述,但其 不代表为本发明的唯一实施方式。
[0030]实施例一、多肽分子的设计与合成 [0031 ] 1、9R-P20
再多了解一些
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1