1多肽的设计与合成
[0032]鉴于P201是分子靶向FoxMlc的DNA结合域蛋白，通过噬菌体随机肽库筛选获得的 多肽序列，而FoxMlc是细胞核内转录因子，P201必需进入细胞(核）内才能发挥其FoxMlc的 抑制作用，一种有效的途径是通过细胞穿膜肽(cell penetrating peptide)的N-端添加以 增强多肽的穿膜能力，而多聚精氨酸的添加是实现该目的的一条有效途径。为此，在P201多 肽氨基酸序列的基础上，通过在P201多肽的N-端添加9R(9聚D-型精氨酸，RRRRRRRRR)的细 胞穿膜肽以提高多肽的穿膜能力以及添加(GS) 2二聚甘氨酸丝氨酸以增强多肽份子的柔 性，设计形成共含25个氨基酸的新设计多肽，简称为9R-P201多肽(SEQ ID No: 2)。该序列送 交专业公司合成，多肽合成步骤如下：
[0033] 合成顺序:从C端到N端。
[0034] a.树脂溶涨
[0035] 将2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反应管中，加 DCM(15ml/g)，振荡30min.
[0036] b.接第一个氨基酸
[0037] 通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Asp(0Tbu)-OH氨基酸，加入DMF 溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA，，振荡60min。用甲醇封闭。
[0038] c.脱保护
[0039] 去掉DMF，加20%哌啶DMF溶液（15ml/g)，5min，去掉再加20%哌啶DMF溶液（15ml/ g)，15min.
[0040] d.检测
[00411 抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105°C - 110°C 加热5min,变深蓝色为阳性反应。
[0042] e.洗
[0043] DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次 [00 44] f.缩合
[0045] 保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入 DIEA十倍过量.反应30min.
[0046] g.检测
[0047] 取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105°C - 110°C加热5min，无色 为阴性反应。
[0048] h.洗
[0049] DMF(10ml/g)-次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
[0050] i .重复三至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。Fmoc-D_Arg(Pbf )-OH 操作步骤也是如此。
[0051 ] j .抽干，按照下列方法洗树脂。
[0052] DMF(10ml/g)两次，甲醇（10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干 10min〇
[0053] k.从树脂上切割多肽
[0054] 配制切割液（l〇/g)TFA 95%;水 1%;EDT 2%;TIS 2%
[0055] 切割时间：240min(常用切割时间一般为120min，针对于本序列Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH较多，侧链Pbf保护基较难脱除，故延长时间。）
[0056] 1.吹干洗涤
[0057]将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。
[0058] m.分析提纯：
[0059]用高效液相色谱将粗品提纯。
[0060] η.冻干
[0061 ]收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
[0062] 〇.将多肽送到质检部确认合格。
[0063] 合成多肽的分子量及组成经质谱鉴定，高效液相色谱(HPLC)确认多肽分子纯度达 到98%以上。
[0064] 2、8R_P201多肽的设计与合成
[0065]类似9R-P201多肽的设计思路与合成，我们同时设计了8R-P201的多肽序列，作为 实施例确定不同个数氨基酸添加或增减对P201多肽生物活性与功效的影响。为此，在P201 多肽氨基酸序列的基础上，通过在P201多肽的N-端添加8R(8聚D-型精氨酸，RRRRRRRR)的细 胞穿膜肽以提高多肽的穿膜能力以及添加(GS) 2二聚甘氨酸丝氨酸以增强多肽分子的柔 性，设计形成共含24个氨基酸的新设计多肽，简称为8R-P201多肽(SEQ ID N〇:3)。该序列 送交专业公司合成，多肽合成步骤同实施例一，获得多肽分子纯度为98%以上。
[0066]实施例二、多肽9R-P201对癌细胞株的杀伤作用
[0067] 1、完全血清培养CCK-8检测9R-P201对肝癌细胞HepG2的杀伤作用
[0068] (1)实验方法
[0069]细胞培养:HepG2肝癌细胞按常规细胞复苏和培养，完全培养基为DMEM+10%胎牛 血清+100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。37°C、5 %的C02培养箱中孵育培养。
[0070]细胞处理:完全培养基按6 X 103细胞/孔的数量铺板96孔细胞培养板，24h后加入 完全培养基配制的1 〇、20、40、60、80、100yg/mL等浓度的9R-P201多肽，12、24h各时间点分别 照相和检测细胞活力。
[0071 ] CCK-8细胞活力测定:将上述96孔细胞培养板继续培养至相应时间点，避光向各孔 加入1〇μ1的CCK_8(凯基），以10%完全培养基为本底，37°C下避光孵育1.5h，A45Qr?处酶标检 测各孔吸光度值。
[0072] (2)实验结果
[0073] 细胞形态学变化及细胞活力结果见附图1，可见，在完全血清培养基条件下，随着 细胞培养时间(从12h到24h)和多肽处理浓度的增加，破裂和成碎片状的死亡细胞数逐渐增 多，其细胞杀伤率也逐步增加，24h处理在80yg/mL时杀伤率达到85 %左右。其IC50值为43.6 μg/ml〇
[0074] 2、无血清培养CCK-8检测9R-P201对肝癌细胞HepG2的杀伤作用
[0075] (1)实验方法：
[0076]细胞培养:同实施例二之1。
[0077]细胞处理:与实施例二之1类似，不同的是，细胞培养24h后各孔加入用无血清培养 基(不含血清，其它与完全培养基相同）配制的10、20、40、60、80、10(^8/11^等浓度的91?-?201 多肽，12、24h各时间点分别照相和检测细胞活力。
[0078] CCK-8活力测定：同实施例二之1。
[0079] (2)实验结果
[0080]细胞形态学变化及细胞活力结果见附图2,可见如同实施例二之1，在无血清培养 基条件下，随着细胞培养时间(从12h到24h)和多肽处理浓度的增加，死亡细胞数逐渐增多， 其细胞杀伤抑制率也逐步增加，但与实施例二之1完全血清处理差异不大，24h时IC50值为 48.7μg/ml。12h处理在80yg/mL时杀伤率达到85 %左右。
[0081 ] 3、完全培养基CCK-8检测9R-P201对人前列腺癌细胞DU145的杀伤作用
[0082] (1)实验方法。
[0083]细胞培养与CCK-8活力测定:同实施例二之1。
[0084] (2)实验结果
[0085] 细胞形态学变化及细胞活力测定见附图3,可见在完全血清培养基条件下，经24hr 培养，如同HepG2细胞，40μg/ml以上浓度，细胞形态开始发生变化，细胞死亡率增加，80yg/ ml浓度下细胞杀伤率在60 %左右。其IC50值为47.6μg/ml，与肝癌细胞的IC50值相近。
[0086] 4、Α0/ΕΒ双染检测9R-P201对人肝癌HepG2细胞的促凋亡和杀伤作用
[0087] (1)实验方法
[0088] 细胞铺6孔板，2.5\105(^118/^11，进行细胞爬片培养；
[0089] 当细胞至80 %左右时，实验组加入40ug/mL和60ug/mL多肽处理24h，48h;
[0090] 爬片移入另一培养皿中，PBS清洗后，加入约100uL Mixed Dyes Reagent(避光）；
[0091] 避光染色约5min，荧光观察和拍照。
[0092] (2)实验结果
[0093] 细胞形态可见对照组(24h和48h)细胞核呈绿色，核染呈正常结构;实验组在24h和 48hr时细胞核染部分有明显的固缩状或圆珠状，镜下橙红(黄)色染色明显，呈现出凋亡的 特征。且随着多肽处理浓度的增加，出现细胞固缩或圆珠状的凋亡细胞增加，揭示了多肽处 理对该细胞的促凋亡和杀伤作用。
[0094] 实施例三、CCK-8检测9R-P201对人正常细胞株的影响
[0095] 1、完全培养基CCK-8检测9R-P201对人脐静脉内皮细胞HUVEC的影响
[0096] (1)实验方法：
[0097] 细胞培养:同实施例二之1。
[0098]细胞处理:与实施例二之1类似，不同的是，细胞培养24h后各孔加入完全血清培养 基配制的10、20、40、60、80、100、12(^8/1^不同浓度的91?-?201多肽，2411照相和检测细胞形 态变化和细胞活力。
[0099] CCK-8活力测定:同实施例二之1。
[0100] (2)实验结果
[0101] 细胞形态学变化及细胞活