及其载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体是一种抗肿瘤小分子多肽pidda及其载体和 应用。
【背景技术】
[0002] 目前，肺癌的发病率和死亡率均居癌症之首，是对人群健康和生命威胁最大的恶 性肿瘤之一。在中国，由于吸烟人数的快速上升，大气污染的日趋严重等因素，近年来肺癌 发病率和死亡率一直呈明显攀升趋势。尽管近几年肺癌治疗包括化疗有了长足的进步，但 是预后仍然不容乐观。过去25年肺癌患者化疗后的5年生存率仍未见显著提高，仅为 15%。因此，加强治疗肺癌的研究，探索新的治疗途径具有十分重要的意义。
[0003] 多肽药物是目前生物医药领域最具成长性的崭新领域，以其高效、安全、特异性强 等特点逐渐用于癌症，传染病等预防和治疗。基因的功能最终要通过其表达产物一一蛋白 质来实现，生物体的一切活动或功能都离不开蛋白质的物质基础。发现和鉴定具有重要功 能的蛋白质，可为新药的开发带来决定性的影响。并且多肽类药物具有分子量小，在人体内 不结存，无副作用，免疫原性小，活性好等优点成为一个研究的热点。
【发明内容】
[0004] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种抗肿瘤小分 子多肽PIDD\其具有抑制肺癌细胞增殖的功效。本发明的另一目的是提供一种能表达上述 抗肿瘤小分子多肽PIDD"的载体。本发明还有一目的是提供上述抗肿瘤小分子多肽PIDDl9 应用。
[0005] 技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为： 抗肿瘤小分子多肽PIDD\其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006] 所述的抗肿瘤小分子多肽PIDDΛ的编码基因，其DNA序列如SEQIDN0.2所示。
[0007] 含有所述的抗肿瘤小分子多肽PIDDA的编码基因的载体。
[0008] 所述的载体，将抗肿瘤小分子多肽PIDDA的编码基因克隆到pCMV-HA真核表达载体 构建而成。
[0009] 所述小分子多肽?100"在制备抗肺癌药物中的应用。
[0010] 本发明人的前期研究结果表明，PIDD可以通过与Keapl分子相互作用，导致促癌信 号通路Nrf2的激活，进而上调多药耐药蛋白MRP1的表达，促进肺癌细胞的耐药存活。因此， 阻断内源性PIDD与Keapl相互作用，便可抑制Nrf2信号通路的激活，进而抑制肿瘤细胞的生 长及肿瘤细胞的增殖等作用。
[0011] 有益效果:与现有技术相比，本发明具有如下的优点及效果:本发明提供的抗肿瘤 小分子多肽能特异性结合Keapl，阻断细胞内源性PIDD与Keapl相互作用，抑制Nrf2信号通 路激活，达到抗肿瘤的效果，在抗肿瘤药物制备中具有广泛的应用。
【附图说明】
[0012]图1是载体质粒pCMV-HA的结构示意图； 图2是多肽?100"重组真核表达载体酶切鉴定结果图； 图3是免疫印迹检测重组多肽PIDDM^表达结果图； 图4是CCK-8实验检测306aa多肽PIDDl^H1299细胞活性的抑制结果图； 图5是PI染色流式细胞术检测306aa多肽PIDDA抑制肺癌细胞进入S期图； 图6是克隆形成实验检测306aa多肽PIDDA抑制H1299细胞增殖结果图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等 译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0014] 实施例l:306aa多肽PIDDA重组 1)重组肽的克隆载体构建 提取人的mRNA，逆转录为CDNA，以CDNA为模板，上游引物P1为5'-GCGAATTCCTGGCCCATCTGGCCCAC-3'（含 EcoR I 酶切位点）；下游引物 P2为5'-GAAGATCTCTAGAAGTGGGGCACCTGGC-3 '（含Bgl Π 酶切位点），应用PCR技术成功扩增出 306aa (SEQIDN0.1)对应的918bp的mRNA序列（SEQIDN0.2)。扩增得到的片段与pCMV-HA载体连 接(载体图见图1)，将连接产物(PIDD质粒)转入感受态大肠杆菌DH5a中，在含Amp琼脂平板 上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoR I、BglΠ 酶切鉴定（图2)。
[0015] 2)重组肽的真核表达载体构建及其表达鉴定 将含有306aa多肽PIDD核酸片段的pCMV-HA质粒经EcoR I酶切后，利用回收试剂盒获 得该片段，同时用相同的酶处理质粒pcDNA3.1(约5kb)，然后将回收多肽核酸片段和经酶切 的载体pCMV-HA在T4 DNA连接酶作用下于16°C连接过夜。酶切鉴定重组体。将正确连接的 306aa多肽真核表达载体转染H1299细胞，48小时后搜集样品，RIPA细胞裂解液裂解，免疫印 迹结果证明了多肽的表达(图3)，分子量大小34KD。
[0016] 主要过程如下： 以cDNA为模板，分别取上下游引物P1和P2各5yL，加入lyL pfuDNA聚合酶，10 X bnuffer 5yL，10 X dNTP 5yL，加双蒸水总体积为50yL进行PCR反应，起始变性94°C5min，然后执行如 下反应条件:94°C30s，65°C30s，72°C45s，30 个循环，最后 72°C 延伸 lOmin。
[0017] 取PCR产物10yL，进行行1.2%普通琼脂糖凝胶电泳，结果扩增出一条约918bp的片 段。取余下PCR产物40yL，进行1.2%低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化918bp的PIDD cDNA片段。
[0018] 将PIDD质粒和HA质粒分别用EcoRI和Bgl II双酶切，前者回收918bp的PIDD片段，后 者回收线性化的HA片段，然后行1.2%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收，将918bp的PIDD片段和 3800bp的线性化的HA片段分别切下混在一起进行纯化。纯化后PIDD片段和HA片段混合物用 4yL双蒸水溶解，加入T4 DNA连接缓冲液2yL，T4DNA连接酶lyL(3U/yL)，总反应体积为10yL， 室温连接4h。将10yL连接产物转化大肠杆菌DH5a，并铺在含氨苄青霉素（lOOyg/mL)的琼脂 培养基上生长12h，挑选单个菌落接种于含氨苄青霉素（100yg/mL)TB培养基中培养12h，少 量提取质粒，通过EcoRI和Bglll双酶切鉴定。然后进行大量提取、纯化，用40yL消毒三蒸水 溶解沉淀，命名为"pCMV-HA-PIDD"，-20°C保存以备用。
[0019] 从40yL