结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于结核病医学免疫学诊断技术领域，涉及一种结核分枝杆菌特异性融合 蛋白及其编码基因与应用，具体涉及一种应用基因工程技术制备的结核分枝杆菌特异性重 组融合蛋白CE及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 结核病是危害人类健康的主要传染病之一，是当前急需解决的公共健康难题之 一。1985年以来艾滋病的流行、结核感染的移民和部分人群生活贫困等原因使美国等欧美 发达国家结核病发病率呈回升趋势，尤其是结核菌耐药和非结核分枝杆菌病发病率上升加 大和阻碍了结核病诊断、治疗的难度和进度。目前全世界有结核病人约2000万，每年新增感 染人数800-1000万，每年死于结核病的人数约140万。
[0003] 我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病疫情和耐药情况都相当严重，结 核病人数位居世界第二，仅次于印度。2010年第五次全国结核病流行病学抽样调查初步结 果表明，现有肺结核病人500-600万，其中传染性肺结核病人约86万，全国肺结核发病人数 和死亡人数位于各种法定传染病的首位。结核病是通过呼吸道传播的传染性很强的疾病， 我国约有三分之一人口感染了结核菌，其中5%可能早期发病，5%可能在其一生中的任何 时候发病。因此，结核高危人群的主动发现、动态监测和预防治疗可有效减少肺结核的发病 率，结核病的早期诊断、发现传染源、有效化疗对于控制结核病及结核菌传播都有极其重要 的意义。
[0004] 目前临床上常规应用的诊断方法中，用于检测排菌肺结核患者的临床标本涂片的 灵敏度低，阳性率只有20-30%，传统的罗氏培养的阳性率也只有30%左右，而且需4-8周时 间，国际认可的分枝杆菌快速培养系统一般也需2周以上，而且试剂昂贵，检测成本高而难 以普及。用于检测结核感染者、辅助菌阴肺结核病患者诊断的结核菌素皮肤试验的特异性 差，不能鉴别卡介苗接种者和部分环境分枝杆菌感染者;血清结核抗体检测的灵敏度和特 异性不理想;近两年开发的γ干扰素释放试验试剂昂贵，技术复杂，不适合于基层或现场应 用。显然目前临床上常规应用的诊断方法不能满足临床医疗的需求，尤其是基层医疗单位 可用的检测方法极少。
[0005] 结核菌素是结核分枝杆菌培养滤液蛋白，其作用于人体会激发已致敏机体产生细 胞免疫反应，激活Τ淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞，释放大量细胞因子，并使这些细胞增 殖、聚集，包裹抗原形成结节，这就是迟发型变态反应，其反应强度与细胞免疫呈平行关系。 结核菌素皮肤试验已成为目前临床上最常用且最简便的一种结核菌感染诊断方法，反应越 强，表示结核感染可能性越大，我国一直使用硬结2 5mm为阳性，2 20mm或有水泡、坏死、淋 巴结炎等为强阳性，3岁以下儿童2 15mm为强阳性的标准。用于结核病皮肤试验的主要试剂 有以下几种：（1)旧结核菌素:不易标准化和易发生非特异性反应，目前已经很少使用。（2) 人型PPD:结核分枝杆菌强毒株培养滤液的纯蛋白衍化物(PH))，由于生产菌株具有很强的 传染性，国家要求该PPD的制备需在负压车间进行，目前国内虽有厂家生产，但尚没有销售 的结核分枝杆菌PPD。（3)卡介菌PPD:是卡介苗菌株的培养滤液纯蛋白衍化物，主要用于检 测卡介苗接种是否成功。在没有人型Pro的情况下，临床上用卡介菌pro替代人型pro进行皮 肤试验，但两者pro成份并不完全一样，因此，卡介菌pro皮肤试验辅助结核病诊断的价值尚 需进一步研究。（4)结核分枝杆菌重组38KD蛋白：目前尚无市售产品。该抗原刺激产生的皮 肤反应较轻，一般不会产生水泡和淋巴管炎等副作用;且该蛋白存在于结核分枝杆菌复合 群中，结核感染者反应强，卡介苗接种者反应弱，因此，它不能完全鉴别结核感染者和卡介 苗接种者。
[0006] ESAT6蛋白是一种低分子量(6kDa)早期分泌性蛋白，由结核分枝杆菌、牛结核分枝 杆菌和少数致病性分枝杆菌基因组的差异区域(RD)1编码，但所有卡介苗菌株及绝大部分 环境分枝杆菌基因组均丢失该区域，不表达ESAT6蛋白。ESAT6蛋白含有多个T淋巴细胞抗原 表位，该蛋白或其多肽可作为T细胞刺激抗原，可用作皮肤试验抗原用于诊断结核菌感染、 辅助诊断结核病。
[0007] CFP10是一个由RV3874基因编码的100个氨基酸的蛋白，其基因位于ESAT6基因的 上游，与ESAT6编码基因均位于RD1，属于同一个lhp-exe操纵子，由同一个启动子调节转录， 两者分布于相同的分枝杆菌中，其基因存在于结核分枝杆菌复合群和少数其他分枝杆菌 (如胃、堪分枝杆菌）中，但在BCG所有菌株中均未发现其基因。CFP10序列与ESAT6基因有约 40%的同源性，其蛋白也属于ESAT6家族的成员之一，两者具有相同的免疫学特性。CFP10蛋 白也含有多个T淋巴细胞抗原表位，该蛋白或其多肽均可作为T细胞刺激抗原。
[0008] ESAT6蛋白和CFP10蛋白所具有的T淋巴细胞抗原表位不同，不同遗传背景的结核 感染者对这两种抗原的反应也不完全相同，一部分结核感染者对这两种抗原的刺激均产生 反应，而部分结核感染者只对ESAT6蛋白或CFP10蛋白起反应。单独应用ESAT6蛋白作为刺激 抗原，部分结核感染者由于对ESAT6蛋白不反应而造成漏诊。因此，提供一种高灵敏度、高特 异性、制备简便、高产的用于诊断结核感染的皮肤变态反应原就成为本技术领域急需解决 的问题。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足之处，提供一种高灵敏度、高 特异性、制备简便、高产的结核分枝杆菌特异性重组融合蛋白，用于人类或动物结核分枝杆 菌引起的感染和疾病的检测。
[0010] 为解决以上技术问题，本发明提供一种蛋白，名称为重组融合蛋白CE，是如下a)或 b)的蛋白质：
[0011] a)SEQIDNo·2所示的蛋白质；
[0012] b)将SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且功能相同的蛋白质。
[0013] 所述重组融合蛋白CE可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 所述b)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No. 1中第4-612位所示的DNA序列缺失或添 加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
[0014] 为解决以上技术问题，本发明还提供与所述蛋白相关的生物材料，为如下B1)或 B2)：
[0015] B1)编码所述蛋白的核酸分子；
[0016] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
[0017] 所述核酸分子可以是DNA，如CDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。
[0018] 上述生物材料中，B1)所述的核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
[0019] 1)SEQ ID No.l中第4-612位所示的DNA分子；
[0020] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0021] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且所述蛋白质的DNA分子。
[0022] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码重组融合蛋白CE的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与 本发明的编码重组融合蛋白CE的核苷酸序列有一定同一性的核苷酸，只要编码重组融合蛋 白 CE且具有重组融合蛋白CE的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的 序列。
[0023] 这里使用的术语"同一性"指与核酸序列的序列相似性。"同一性"可以用肉眼或计 算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表 示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0024] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码重组融合蛋白CE的核酸分子的表达盒，是指 能够在宿主细胞中表达重组融合蛋白CE的DNA，该DNA不但可包括启动编码重组融合蛋白CE 的基因转录的启动子，还可包括终止编码重组融合蛋白CE的基因转录的终止子。进一步，所 述表达盒还可包括增强子序列；
[0025] 可用现有的表达载体构建含有编码重组融合蛋白CE的核酸分子的重组载体，现有 的表达载体如pET系统、pGEX;
[0026] 所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；
[0027] 所述重组微生物具体可为细菌、藻和真菌，其中，细菌可为大肠杆菌；
[0028] 所述转基因细胞系为非繁殖材料。
[0029] 为解决以上技术问题，本发明还提供所述蛋白的制备方法，包括如下步骤:将编码 所述蛋白的核酸分子导入宿主菌中得到重组菌，诱导重组菌表达所述蛋白。
[0030] 上述方法中，所述核酸分子是通过重组表达载体导入所述宿主菌的；
[0031 ] 所述重组表达载体具体是将SEQIDNo.3所示的DNA分子替换pET-30a( + )的NdeI 和Xho頂每切位点间序列，pET-30a( + )的其余序列不变得到的；
[0032] 所述宿主菌具体为大肠杆菌；
[0033] 所述表达包括将所述重组菌在发酵培养基中进行发酵培养，并用IPTG诱导使所述 重组菌表达所述蛋白；
[0034]所述发酵培养基具体包括蛋白胨8-128/1、氯化钠1.5-2.58/1，磷酸二氢钾6.0-7.5g/L，三水合磷酸氢二钾11.0-12. Og/L，硫酸铵1.8-2.2g/L，消泡剂0.4-0.6ml/L;再具体 包括蛋白胨l〇g/L、氯化钠2. Og/L，磷酸二氢钾6.8g/L，三水合磷酸氢二钾11.4g/L，硫酸铵 2.(^/1，消泡剂0.51111/1;
[0035] 所述发酵培养的条件具体为:温度36.5-37.5°C，pH 6.7-6.9,溶氧30-80%;
[0036] 所述温度具体为37°C，pH具体为6.8;
[0037] 所述IPTG诱导具体是在发酵培养的培养液的0D6Q()达到20-40时开始诱导，IPTG终 浓度为〇. 4-0.6mM;再具体是在发酵培养的培养液的OD600达到25-35时开始诱导，IPTG终浓 度为0.5mM;
[0038] 所述发酵培养还可以采用指数流加补料策略，以发酵培养的培养液的糖含量小于 lg/L为标准调节补料培养基的补加速度；
[0039]所述补料培养基具体包括葡萄糖350-370g/L、七水合硫酸镁12-18g/L、酵母抽提 物470-490g/L;再具体包括葡萄糖360g/L、七水合硫酸镁15g/L、酵母抽提物480g/L;
[0040]所述表达之后还包括纯化的步骤，所述纯化包括将所述发酵培养的重组菌进行破 碎、收集上清、超滤和/或离子交换层析的步骤；
[0041]所述离子交换层析具体为阴离子交换层析，再具体为DEAE sepharose Fast Flow 柱层析、Aminobutyl Sepharose 6Fast Flow柱层析和/或Q Sepharose High Performance 柱层析。
[0042] 为解决以上技术问题，本发明还提供上述蛋白和/或上述任一所述的生物材料在 制备检测或辅助检测结核分枝杆菌感染的产品中的应用。
[0043] 上述应用中，所述产品为变态反应原；
[0044] 所述变态反应原具体为皮肤变态反应原。
[0045] 为解决以上技术问题，本发明还提供上述蛋白和/或上述任一所述的生物材料在 制备检测或辅助检测结核分枝杆菌引起的疾病的产品中的应用。
[0046] 上述应用中，所述疾病为结核病；
[0047] 上述应用中，所述结核病为肺结核或肺外结核；
[0048]所述肺结核具体为菌阴肺结核。
[0049]上述任一所述的应用中，所述结核分枝杆菌为结核分枝杆菌Η 3 7 R v (]\1.1：油61'(3111〇818)或牛结核分枝杆菌(]\1.130￥18)。
[0050] 上述任一所述的应用中，所述产品在结核分枝杆菌感染者或结核病患者的皮肤试 验中能导致迟发型超敏反应。
[0051] 本发明通过分析结核分枝杆菌CFP10和ESAT6的基因序列和蛋白质结构，确定两个 蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序，根据大肠杆菌的密码子使用频率，选择其中高频率 的密码子即最佳密码子或偏爱密码子，去除一些稀有或利用率低的密码子，通过同义密码 子替换原有密码子进行优化，设计出重组融合蛋白CE的编码基因；进一步利用载体pET-30a (+ )构建含有融合蛋白CE的编码基因的重组表达载体CE/pET-30a，并制备得到CE/pET-30a 大肠杆菌工程菌；IPTG诱导CE/pET-30a大肠杆菌工程菌表达重组融合蛋白CE并对其进行进 一步纯化。本发明提供的重组融合蛋白CE是将结核分枝杆菌两种蛋白CFP10和ESAT6关键的 抗原表位依次连接构成，其中CFP10蛋白的抗原表位