一种由液体和半固体发酵工艺结合高密度生产解淀粉芽孢杆菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种由液体和半固体发酵工艺结合高密度 生产解淀粉芽孢杆菌的方法。
【背景技术】
[0002] 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种具有广谱抑菌活性的细 菌，具有较强的次生代谢产物产生能力，能抑制尖孢镰刀菌等多种植物病原真菌。
[0003] 目前国内外对解淀粉芽孢杆菌发酵的优化主要集中在产抗菌脂肽、α-淀粉酶、蛋 白酶等酶类物质，较少研究解淀粉芽孢杆菌数量发酵工艺优化;而在此类菌数量发酵优化 研究中，多数研究的目标在解淀粉芽孢杆菌液体深层发酵技术，对解淀粉芽孢杆菌高密度 发酵工艺技术的研究较少。但从微生物菌剂的产业化和规模化，半固体发酵技术在生产上 更具实际意义。
[0004] 当前，芽孢杆菌产品的工业化生产方式主要分为液体深层发酵和固体发酵，液态 深层发酵优点是发酵过程易于控制，自动化程度高，产品纯度高，但对设备要求高，投资较 大，耗能高，环境污染严重并且发酵后需要吸附干燥，工艺程序多；固体发酵其优点是发酵 产量高且发酵后不需要吸附，直接烘干粉碎即可使用，工艺简单，生产成本低，缺点是发酵 过程不易于控制，杂菌污染不易控制。半固体发酵是固体发酵的一种类型，是指在培养基呈 固态，虽然含水丰富，但在没有或基本没有自由流动水的状态下进行的一种微生物发酵过 程。
[0005] 其中中国专利ZL201110428027.7公开了一种畜禽用凝结芽孢杆菌高密度发酵方 法及其制备的制剂和应用，首先对凝结芽孢杆菌进行液体发酵，然后进行固体变温连续发 酵，固体发酵后期进行通风，继续发酵兼干燥，干燥结束，获得凝结芽孢杆菌制剂初产品，经 进一步粉碎过筛，获得高密度凝结芽孢杆菌菌剂终产品，终产品菌体数可达115.5 X 108cfu. g-Ι，芽孢率可达77.2 %。但存在终产品菌体量较低、芽孢率低等问题。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种由液体和半固体发酵工艺结合高密度生产解淀粉芽 孢杆菌的方法，解决了工业化生产解淀粉芽孢杆菌存在的菌体量和芽孢率低的问题。
[0007] 本发明采用的技术手段如下:一种由液体和半固体发酵工艺结合高密度发酵生产 解淀粉芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
[0008] ①液体发酵
[0009] 将解淀粉芽孢杆菌的种子液接种至液体发酵培养基，接种量为1-5%，在温度为 35-38°C，通入空气量为25-35L/min，压力为0.02-0.04Mpa的条件下培养20-26h后获得液体 发酵产物；
[0010]液体发酵培养基包括18-22g/L蔗糖、8-12g/L豆柏粉、0 · 8-1 · 2g/L酵母粉、1 · 0- 1.4g/LK2HP〇4P0.8-1.2g/LMgCL2;
[0011] ②半固体发酵
[0012] 将液体发酵产物接种至半固体发酵培养基并混合均匀，接种量为18-22 %，在温度 为35-38°C、湿度为50-70 %的条件下培养4-6天，获得半固体发酵产物；
[0013] 半固体培养基按重量份计，包括80-100份玉米粉、8-12份大米粉、35-50份椰糠粉、 14-17份木薯渣粉和160-200份水。
[0014]优选地，解淀粉芽孢杆菌的种子液浓度为1.2X 101Q-5.6X 101Qcfu/mL。
[0015] 优选地，一种由液体和半固体发酵工艺结合高密度发酵生产解淀粉芽孢杆菌的方 法，包括以下步骤：
[0016] ①液体发酵
[0017] 将解淀粉芽孢杆菌的种子液接种至液体发酵培养基，接种量为3%，在温度为37 °C，通入空气量为30L/min，压力为0.03Mpa的条件下培养24h后获得液体发酵产物；
[0018]解淀粉芽孢杆菌的种子液包括浓度为4.0 X 101()cfu/mL解淀粉芽孢杆菌；
[0019]液体发酵培养基包括20g/L鹿糖、10g/L豆柏粉、1. Og/L酵母粉、1.2g/LK2HP〇4和 1.Og/L MgCL2 ；
[0020] ②半固体发酵
[0021] 将液体发酵产物接种至半固体发酵培养基并混合均匀，接种量为20%，后在温度 为37°C、湿度为60 %的条件下培养5天，获得半固体发酵产物；
[0022]半固体培养基按重量份计，包括90份玉米粉、10份大米粉、40份椰糠粉、15份木薯 渣粉和200份水。
[0023] 优选地，解淀粉芽孢杆菌的种子液由以下方法培养获得:将解淀粉芽孢杆菌接种 于LB培养基培养32h_48h，后接种至液体种子培养基培养获得种子液，所述液体种子培养基 包括蔗糖20g/L、酵母粉 10g/L、K2HP〇4l · 2g/L、MgCL2l · Og/L和消泡剂0 · 2mL。
[0024] 通过本发明将由液体和半固体发酵工艺结合及其工艺参数优化，获得的解淀粉芽 孢杆菌终产物菌体含量为3.21 X 1012cfu/g、芽孢率高达93%。
[0025] 本发明提供了一种由液体和半固体发酵工艺结合高密度生产解淀粉芽孢杆菌的 方法，该方法将液体发酵生产与半固体发酵生产相结合，先利用液体培养快速生长的芽孢 菌体，然后转接到含有椰糠粉和木薯渣粉的半固体营养基质上产生大量芽孢，从而在提高 菌体产率和芽孢率的基础上，大批量生产。
[0026]进一步地，本发明提供的方法，生产工艺简单，显著提高芽孢产量，减少了培养过 程中的污染机率，而且不需要复杂设备。
[0027] 本发明提供的方法中，培养基的原料主要为热带特有加工副产品和常见的农副产 品。椰糠粉和木薯渣粉是热带地区所特有的加工副产物，椰糠粉是椰子外壳的纤维粉末，是 从椰子外壳纤维加工过程中脱落下的一种可以天然降解、纯天然的有机质媒介。椰糠粉在 半固体发酵起到良好通气性、保水性并且能提供微生物发酵所需的微量元素。木薯渣粉是 木薯提取淀粉后的副产物，主要指标包括粗纤维、少量淀粉和粗蛋白，木薯渣粉含有丰富的 矿物质(包括氮、磷、钾、碳、钙、镁、硫、锌、锰、铜、铁和钠）。米粉、玉米粉来源广泛、充足，成 本低廉，易调控，成功率高。
[0028] 综上所述，本发明提供的解淀粉芽胞杆菌的培养方法，生产工艺经济实用、生产效 率高、投资少、占地小、生产可以实现规模化且无三废问题，适于大量推广应用，将产生巨大 的经济效益。
【具体实施方式】
[0029]以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于 限定本发明的范围。
[0030] 本发明选用的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HC200,其在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 10371，该菌株在 申请专利CN201510653843.6公开。解淀粉芽胞杆菌（Bacillus &11171〇1丨9116€&(^6118)!15，其 保藏于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。
[0031]本发明生产出的解淀粉芽胞杆菌发酵物干燥成粉剂可直接用于防控香蕉枯萎病， 番茄青枯病，甜瓜枯萎病，马铃薯疫病，苹果红腐病，黑星病等土传病害和芒果炭疽病、甜瓜 白粉病、葡萄白粉病等地上病害。
[0032] 实施例一：
[0033] 解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)HC200的生产方法包括以下步 骤：
[0034] 1、菌种培养
[0035]将解淀粉芽孢杆菌HC200接种于LB培养基平板，在37°C培养32h直至菌体长满平 板。
[0036] LB培养基:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂17g，用水定容至1000ml， pH为7.0。
[0037] 2、液体种子培养
[0038]在1000ml三角瓶中装入400ml液体种子培养基，然后接种步骤1培养得到的菌种， 接种量为每个三角瓶接种1/6的培养皿平板菌种（培养皿规格为90mm)，37°C、180rpm培养 24h，得到种子液，种子液中的菌浓度为1.2 X 101Qcfu/mL。
[0039] 液体种子培养基:取蔗糖20g、酵母粉10g、K2HP〇4l.2g和MgCL2lg，溶于水并用水定 容至1000mL ;pH=6.5;121°C高压灭菌20分钟，冷却至40°C后用于接种。
[0040] 3、液体发酵生产
[0041] 在100升机械搅拌发酵罐中装入60升液体发酵培养基，然后接种步骤2得到的种子 液，接种量为1% (即每1份体积种子液接种至99份体积液体发酵培养基）。
[0042] 培养条件:35°C，通入空气且通气量为25L/min，保压0.02Mpa，培养20h。
[0043]完成上述培养后，将发酵罐内的所有物质作为液体发酵产物。
[0044]通过显微镜观察到液体发酵产物中出现大量芽孢菌体，发酵液浑浊。
[0045]液体发酵培养基:取蔗糖18g、豆柏粉12g、酵母粉0.8g、K2HP〇4l. 0g和MgCL20.8g，消 泡剂0.2ml，溶于水并用水定容至1000mL;pH=6.5; 121°C高压灭菌20分钟，冷却至40°C后用 于接种。
[0046] 4、半固体发酵生产
[0047]培养架:腔内具有尼龙纱网隔层的四立柱架子，长3.2m、宽0.7m、高2.6m，用不漏水 尼龙纱网隔成7层结构，层间距30cm，四立柱材质是碳钢喷塑。
[0048] 半固体发酵培养基按重量份数计:将100份玉米粉、8份大米粉、50质量份椰糠粉、 14质量份木薯渣粉和170份水混合均匀；自然pH;在121°C蒸汽灭菌60分钟。
[0049] 在经甲醛和高锰酸钾薰蒸灭菌的发酵室内，将液体发酵产物接种至半固体发酵培 养基并混合均匀，接种量为18% (即18体积份液体发酵产物接种至82体积份半固体发酵培 养基），然后将混合物置于发酵室内的培养架的尼龙纱