一种慢生型大豆根瘤菌液体保护剂的制作方法

文档序号:9762764阅读:1110来源:国知局
一种慢生型大豆根瘤菌液体保护剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种大豆根瘤菌保护剂。
【背景技术】
[0002] 在大豆生产过程中使用根瘤菌接种剂是一项成熟的技术,在增加产量、提高大豆 品质等方面已得到广泛的认可。据文献报道国外使用根瘤菌接种剂的大豆田占总播种面积 的30~50%,有些国家可以达到70%以上甚至更高;而我国接种根瘤菌剂的面积仅占播种 面积的1~3%。近年来黑龙江省政府为加快推广大豆根瘤菌技术,促进大豆增产提质、节本 增效,每年拿出500万元财政资金,在全省大豆主产区以补贴和自筹相结合的方式推广大豆 根瘤菌接种剂技术,并结合大豆高产创建、科技示范园区建设、大豆测土配方施肥等办法推 动大豆优质化生产。国内从事根瘤菌研究的机构和人员不胜枚举,研究的方向、领域和取得 的科研成果数不胜数,但实际应用却少得可怜。根瘤菌剂应用不广泛的原因有很多,其中一 个主要原因就是大豆根瘤菌剂产品在土壤中不能形成比较优势,在土壤中的存活率低,与 土著根瘤菌相比竞争力弱,造成使用效果不理想。在使用根瘤菌接种剂的同时配伍使用保 护剂可以解决这一问题。
[0003] 作为中国绿色大豆的主产区,近年来黑龙江省始终保持每年4000万亩左右的大豆 种植面积,农垦九三管理局和黑河地区作为全国非转基因大豆主产区,多年来始终致力于 绿色大豆产业发展,先后投入10亿多元用于绿色大豆标准化基地建设,建立非转基因大豆 核心示范区。目前这一区域内大豆种植面积在2000万亩以上,年产量达到200万吨以上。但 根瘤菌剂的应用还很少,仅占播种面积的2%左右,根瘤菌剂应用前景广阔。
[0004] 大豆根瘤菌剂保护剂是一种与根瘤菌剂配合使用的活性物质,对根瘤菌剂具有营 养和保护作用,并能够促进根瘤菌剂在大豆种子表面成膜和保持一定的种群优势,提高根 瘤菌剂的使用效果。由于根瘤菌的多样性,针对每一种根瘤菌剂,应该有专门的保护剂。
[0005] 目前,对根瘤菌剂保护剂的研究报道还不多见。而且大部分研究的重心放在了对 菌剂的保存期和保藏效果上,而不是提高大豆种子表面成膜能力、形成菌群优势、促进结瘤 等方面。

【发明内容】

[0006] 本发明利用响应面法研究具有根瘤菌保护作用的蛋白类、盐类、糖类和微量元素 类物质,通过不同种类、不同组合、不同配比、不同浓度的比较分析,在实验室中模拟实际应 用条件,提供一种具有提高根瘤菌存活率和存活时间作用的慢生型大豆根瘤菌液体保护 剂。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0008] -种慢生型大豆根瘤菌液体保护剂,由YMA培养基、蛋白胨、黄原胶、NaCl、硼酸制 成,其中:蛋白胨的含量为0.1~〇.2 Wt%、黄原胶的含量为0.01~0.02wt%、NaCl的含量为 0.25~0.35¥七%、硼酸的含量为0~0.01¥七%。
[0009] 按照质量比由混合而成。
[0010] 本发明具有如下优点:
[0011] 1、本发明提供的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂中既有维持微生物渗透压的盐类、 糖类物质,又有刺激菌剂和大豆生长的蛋白质和微量元素,还有能够有效成膜、促进根瘤菌 在大豆表面形成比较优势的蛋白类物质,在实际应用中会形成占位优势,抵御土著根瘤菌 的侵染,增加有效结瘤数量,提高接种根瘤菌剂的使用效果。
[0012] 2、与根瘤菌剂配伍使用,可以提高根瘤菌剂在土壤中的存活率,能在大豆种子表 面形成比较优势,抵御土著根瘤菌的竞争,减少无效结瘤,为最终实现大豆根瘤菌剂的大面 积推广与应用,提尚我省大?广量和品质打下基础。
【具体实施方式】
[0013] 下面对本发明的技术方案作进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术 方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明 的保护范围中。
【具体实施方式】 [0014] 一:本实施方式提供的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂由ΥΜΑ培养基 (磷酸氢二钾〇. 5g,硫酸镁0.2g,氯化钠0. lg,酵母提取物0.4g,甘露醇10g,琼脂20g,ρΗ7.0, 蒸馏水1000ml)、蛋白胨、黄原胶、NaCl、硼酸制成,其中:蛋白胨的含量为0.1~0.2wt %、黄 原胶的含量为0.01~〇.〇2wt%、NaCl的含量为0.25~0.35wt%、硼酸的含量为0~ 0.0 lwt%。
【具体实施方式】 [0015] 二:本实施方式与一不同的是,蛋白胨的含量为0.1~ 0.2¥七%、黄原胶的含量为0.01~0.02¥七%、恥(:1的含量为0.25~0.35¥七%。
【具体实施方式】 [0016] 三:本实施方式与二不同的是,蛋白胨的含量为 0.18?七%、黄原胶的含量为0.015¥七%、他(:1的含量为0.28¥七%混合而成。
【具体实施方式】 [0017] 四:本实施方式与二不同的是,蛋白胨0.15wt %、黄原 胶0.012¥丨%、恥(:10.33¥丨%混合而成。
【具体实施方式】 [0018] 五:本实施方式与一不同的是,蛋白胨的含量为0.1~ 0 · 2wt %、黄原胶的含量为0 · 01~0 · 02wt %、NaCl的含量为0 · 25~0 · 35wt %、硼酸的含量为 0.005 ~O.Olwt%。
【具体实施方式】 [0019] 六:本实施方式与五不同的是,蛋白胨的含量为 0.18¥七%、黄原胶的含量为0.015¥七%、他(:1的含量为0.28¥七%、硼酸的含量为0.008¥七%。
【具体实施方式】 [0020] 七:本实施方式与五不同的是,本蛋白胨的含量为 0 · 15wt %、黄原胶的含量为0 · 012wt %、NaCl的含量为0 · 33wt %、硼酸的含量为0 · lwt %。
【具体实施方式】 [0021] 八:本实施方式提供了一种慢生型大豆根瘤菌液体保护剂,通过对 血清蛋白和蛋白胨等蛋白类物质,氯化钠、氯化钾和氯化钙等盐类,黄原胶、葡萄糖、蔗糖、 海藻糖等糖类,钼酸铵、硼酸等微量元素进行单因素比较研究,以根瘤菌存活时间和存活率 为指标,确定各单因素的种类和浓度。采用响应面法进行统计分析,复配保护剂配方,通过 盆栽实验验证,筛选保护剂组合。具体内容如下:
[0022] 1.试验材料与方法 [0023] 1.1试验材料
[0024] 1.1.1培养基
[0025] YM培养基:磷酸氢二钾0.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠0. lg,酵母提取物0.4g,甘露醇 10g,pH7 · 0,蒸馈水 1000ml。
[0026] YMA培养基:磷酸氢二钾0.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠0. lg,酵母提取物0.4g,甘露醇 l〇g,琼脂 20g,pH7 · 0,蒸馏水 1000ml。
[0027] 1.1.2供试菌种
[0028] 慢生型大豆根瘤菌;大豆品种:黑河43号。
[0029] 1.2试验方法
[0030] 1.2.1慢生型大豆根瘤菌活化
[0031]取一环于_80°C保存的慢生型大豆根瘤菌,接种到装有5mL的YM液体培养基的试管 中,于28°C,180rpm培养3d。用接种环将慢生型大豆根瘤菌菌液划线接种到YMA平板上,28°C 放置恒温培养箱,倒置静止培养7d左右直至出现单菌落为止。再挑取单菌落接种到YM液体 培养基中,28°C,180rpm培养3d待用。
[0032] 1.2.2慢生型大豆根瘤菌发酵培养
[0033] 挑取一环新鲜的平板种子接种于250ml的三角瓶中,装液量为30ml,28°C180rpm振 荡培养3d后,以2%的接种量接种于500ml的三角瓶中,装液量为100ml,28°C180rpm振荡培 养3d后分装到试管中,每支试管10ml。
[0034] 1.3活菌计数
[0035]平板菌落计数法:取100ul慢生型大豆根瘤菌菌液样品,加入装有900ul无菌水的 离心管中,即为10-1稀释液,再用200ul移液枪吸取10-1稀释液100ul移入装有900ul无菌水 的离心管中,即为10- 2稀释液,以此类推,一定要注意每次更换枪头,制成10-3、10-4、10- 5、1〇 'ΙΟΛΚΓ8等一系列稀释度的菌液,供平板计数使用。分别涂布平板,28°C培养7d后计数。
[0036] 1.4筛选显著因子
[0037] 采用不同种类、不同配比进行单因素、两因素、三因素和四因素试验,对蛋白类、盐 类、糖类和微量元素四大类,12种化合物,即牛血清蛋白、蛋白胨、黄原胶、海藻糖、蔗糖、葡 萄糖、羧甲基纤维素钠、似(:1、1((:1工 &(:12、钼酸铵、硼酸进行全面考察。选择12因子6水平的 试验设计,每个因子取6个水平,使水平成梯度变化,检测各梯度下的有效活菌数,从而确定 最大响应面值的区域,筛选出显著因子及最佳终浓度,最终筛选组合获得效果较好的配方。 [0038] 表1-1不同种化合物
[0039]
[0040] 表卜2设计因子与水平
[0041]
[0043] 1.5响应面分析
[0044] 确定了影响慢生型大豆根瘤菌的各主要因子,爬坡实验确定了3-4个主要因子响 应区域的中心点,在主要因子的响应区各取3-4个水平,设计3因素3水平和4因素3水平的响 应面分析试验。
[0045] 1.6数据分析
[0046] -个处理包含3个平行试验,取值为3个平行试验的均值。Plackett-Burman设计采 用Minitab 16软件完成,Box-Behnken设计的响应面分析由Design-Expert 8.0完成。
[0047] 1.7保护剂对根瘤菌的作用效果
[0048
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