一种甲基营养型芽孢杆菌nkg-1及植物促生方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌，还涉及利用该菌株实施的植物促生方法， 具体涉及一种甲基营养型芽抱杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)，及其对 番茄、小白菜、辣椒的促生方法。
【背景技术】
[0002] 为了促进植物生长，例如各种农作物，目前通常会对植物各个生长阶段施加肥料， 其中施加的主要是化学肥料，具有施肥方便、见效快等特点。但是长期大量施用化学肥料导 致残留及环境污染，最终危害人类健康并破坏生态平衡。生物促生因其对环境、生态及人类 健康安全、无毒等优点得到了世界各国的广泛重视并发挥着越来越重要的作用。
[0003] 芽孢杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的腐生细菌，是一群好氧兼厌氧 的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称。芽孢杆菌属的细菌具有生长速度快、营养需求简单、有较 强的耐热性及抗逆性;利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与 繁殖。此外，还具有在植物表面易于存活与繁殖、对人畜无害、不污染环境、制剂稳定、施用 方便等优势而备受瞩目。不仅符合人们对绿色食品的需求，而且为农业的可持续发展提供 了保障。芽孢杆菌作为一种理想的生防微生物，逐渐成为近年来研究的热点并越来越引起 人们重视。目前，具有促生作用的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡 样芽抱杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)、苏云金芽抱杆 菌（Bacillus thuringiensis)、多粘类芽抱杆菌（Bacillus polymyxa)、短小芽抱杆菌 (Bacillus pumilus)等。
[0004] 由于芽孢杆菌既具有广阔的开发应用前景，开发新筛选的未定种的芽孢杆菌及对 新菌株的促生作用进行鉴定是具有非常重要的意义的。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的需求，本发明的目的在于提供一种甲基营养型芽孢杆菌 (Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)，是一种全新筛选出来的株系，还提供了一 种利用甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)实施的植物促 生方法，具有明显的促生作用，因此具有良好的应用前景。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] -种甲基营养型芽抱杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)，所述甲 基营养型芽孢杆菌NKG-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号 码是CGMCC12055，保藏日期是2016年1月15日。
[0008] 利用前述的甲基营养型芽孢杆菌NKG-1实施的植物促生方法，用于促进植物生长 发育。
[0009] 进一步，使用所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液对植物生长期进行灌根，或者 在植物播种之前浸种;或者将所述菌液制备成可湿性粉剂再稀释制得液剂，利用所述液剂 对植物生长期进行灌根，或者在植物播种之前浸种。
[0010] 进一步，所述植物为番茄、小白菜或辣椒。
[0011] 进一步，所述植物为番茄，在番茄幼苗长出2片真叶时利用所述菌液灌根，每隔10 天灌根一次，其他时间浇灌清水，共灌根三次。
[0012] 进一步，所述植物为小白菜，在小白菜播种之前利用所述菌液浸泡小白菜种子 24h，然后实施播种。
[0013] 进一步，所述植物为辣椒，在辣椒幼苗长出2片真叶时利用所述菌液灌根，每隔10 天灌根一次，其他时间浇灌清水，共灌根三次。
[0014] 进一步，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液浓度为lX(106-109)cfu/mL。
[0015] 进一步，所述甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的菌液浓度为lX107cfu/mL。
[0016] 本发明利用甲基营养型芽抱杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1) 实施的植物促生方法具有以下优点：
[0017] 菌株NKG-1菌液灌根对番茄苗具有明显的促进生长的作用，菌液灌根后的番茄苗 与对照组相比生长迅速，叶片浓密，茎部粗壮，尤其是根系发达，根长增加显著，其株高比对 照组增加了 11.88 %，鲜重增加了 34.93 %，根长增加了 54.68 %。
[0018] 菌株NKG-1菌株菌液可以明显促进小白菜的生长，菌液浸种后的小白菜苗比对照 组根长增加43.10%，鲜重增加了36.71 %，干重增加了33.33 %。菌液浸种后的小白菜苗真 叶比对照组出现的早，叶片大，叶柄粗，根系发达，生长更均一、旺盛。
[0019] 菌株NKG-1菌液灌根对辣椒苗具有明显的促进生长的作用，菌液灌根后的辣椒苗 与对照组相比生长迅速，叶片浓密，茎部粗壮，尤其是根系发达，根长增加显著，比对照组根 长增加31.37 %，鲜重增加了 27.54 %，干重增加了 36.31 %。
[0020] 本发明属于生物促生，对环境无污染，没有农药残留，不会破坏生态平衡。
【附图说明】
[0021] 图1为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的电子显微镜扫描图片（ΙΟμπι级别）；
[0022]图2为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的电子显微镜扫描图片(2μπι级别）；
[0023]图3为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的电子显微镜扫描图片（Ιμπι级别）；
[0024] 图4为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对番茄的促生效果对比图（植物幼苗俯视）；
[0025] 图5为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对番茄的促生效果对比图（植物幼苗主视）；
[0026] 图6为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对小白菜的促生效果对比图（植物幼苗俯视）；
[0027] 图7为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对小白菜的促生效果对比图（植物幼苗主视）；
[0028] 图8为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对辣椒的促生效果对比图（植物幼苗俯视）；
[0029] 图9为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1对辣椒的促生效果对比图（植物幼苗主视）；
[0030] 图10为甲基营养型芽孢杆菌NKG-1的系统发育分析图。
【具体实施方式】
[0031] 为更进一步阐述本发明为达到预定技术目的所采取的技术手段及功效，以下结合 附图和较佳实施例，对本发明的结构、特征以及功效详细说明如下。
[0032] 本发明所提供的菌株为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)，是从吉林长白山地区分离获得的，已于2016年1月15日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为No. 12055。
[0033] (一）甲基营养型芽抱杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的分离 与纯化
[0034] 本发明的甲基营养型芽抱杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)是 从吉林长白山土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
[0035]从土壤中分离:称取土样lg，放入盛有99ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡 摇匀30min，然后用移液枪从三角瓶中吸取lml，加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混和均 匀，以此类推分别制成1 0-2、1 0-3、1 0-4不同稀释度的土壤溶液。取1 〇〇yL 土壤溶液涂布于TSA 培养基平板上，每个稀释度做3个重复，28°C培养2-3d。挑取单菌落于TSA培养基平板上划 线，定时观察菌落生长情况，然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别制作斜面标号 保存于4°C冰箱。胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA)配方：（g/L)胰蛋白胨15.0 ;大豆蛋白胨 5.0;氯化钠5.0;琼脂15.0;pH值7.3 ±0.2;称取后，加热搅拌溶解于蒸馏水中，分装三角瓶， 121°C高压灭菌，倒平板。
[0036] (二）甲基营养型芽抱杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的形态 观察
[0037] 采用梯度稀释法制备strain NKG-1菌悬液，吸取30yL适宜浓度的菌悬液涂布于 LB、NA、PDA培养基平板上进行单孢培养，24h-48h后对长出的单菌落的大小、形状、表面、边 缘、颜色及透明度等培养特性进行观察。
[0038] 在LB培养基上培养strain NKG-1菌株，采用插片培养法（阎逊初，1984)在光学显 微镜下观察芽孢生长情况及形态特征，光学显微镜镜检时用镊子小心拔出盖玻片，有菌的 一面朝下放在载玻片上直接观察即可；电子显微镜镜检时先将盖玻片放入2-4%戊二醛固 定液中固定1-2天，0.1M pH7.2PBS缓冲液洗，用1 %0s04固定后1-2小时，再用重蒸水冲洗30 分钟，随后用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水，每级15-20分钟，样品 脱水后用醋酸异戊酯处理，C0 2临界点干燥，干燥好的样品粘贴在样品台上，用离子溅射仪 表面喷金，喷金后样品在扫描电镜下扫描，观察芽孢形态拍照并记录。
[0039] 通过培养和观察发现菌体呈短杆状，芽孢椭圆形，位于菌体中央或稍偏，芽孢大小 在1.5μπι-2.2μπι范围内。菌落为圆形，LB培养基表面和边缘均光滑，NA、PDA培养基表面有褶 皱(NA固体培养基：牛肉浸膏3 · 0g，蛋白胨5 · 0g，葡萄糖20 · 0g，琼脂17 · 0g，蒸馏水1000mL， PH7.0。），不透明，呈白色。革兰氏染色阳性。（电子显微镜扫描图片见图1、图2、图3)
[0040] (三）甲基营养型芽抱杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的生理 生化特性分析
[0041] 挑取单菌落进行形态观察及生理生化测定，生理生化测定参照东秀珠等方法，分 别设计吲哚试验、淀粉水解试验、甲基红试验、柠檬酸盐利用试验、尿素试验、产H 2s试验、葡 萄糖产气试验及乳糖利用试验，充分验证其菌株的生理生化特征。生理生化特性测定，吲哚 试验和甲基红试验为阴性，能利用柠檬酸盐和尿素，有淀粉水解反应发生，能产生出5,能利 用乳糖产酸产气。
[0042] (四）甲基营养型芽抱杆菌（Bacillus methylotrophicus strain NKG-1)的 16s rRNA基因序列鉴定
[0043] 将单菌落接种于LB培养基中，培养经过24h小时后，取luL进行菌落PCR验证。用于 菌液PCR扩增的引物如下：正向引物F: 5 ' -GCAGTCGAGCGGACAGAT-3 ' ；反向引物R: 5 ' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3' dPCR反应体系如下：2XTaqPCRmastermixl2.5uL，正向F引物 10.5uL，反向R引物0.5uL，菌液模板DNA luL，ddH20 10.5uL，总体系25uLdPCR扩增条件为： 94°〇5111；!_11;94°(31111；!_11;51°〇3〇8;72°(31111；!_11，35个循环;72°(31〇111；!_11。电泳采用琼脂糖凝胶电泳， 核酸染料为EB，Maker为DL2000。最后将PCR纯化产物送上海生工生物工程有限公司进行测 序。所得序列NCBI GeneBank核酸数据库中相关序列进行比对分析^用正向引物F和反向引 物R进行16SrRNA进行PCR扩增，得到1397kb的片段^通过比对该序列与甲基营养型芽孢杆菌 16S rRNA基因在相应区域核苷酸序列相似性均为100%。
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