一种脐带间充质干细胞的分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)是一群具有强大的增殖能力和多向分化潜能的干细胞，在免疫调节和抗炎症反应方面效果显著，因此被大量应用于临床研究和治疗，其适应症涵盖移植物抗宿主反应(GVHD)、神经系统疾病、糖尿病、肝病等多种重大疾病。
[0003]脐带间充质干细胞是从新生儿脐带中分离获得，具有更加原始、增殖能力更强和免疫原性更低等特点，同时脐带间充质干细胞来源丰富、取材方便且没有伦理等因素的限制，是目前间充质干细胞最重要的来源。
[0004]研究表明，每厘米脐带中理论上含有约IXlO6个间充质干细胞。目前国内外常用的分离方法主要有酶消化法和组织块贴壁法两种:酶消化法成本高，容易对细胞造成的损伤甚至细胞突变，临床应用存在极大风险；组织块贴壁法具有操作简便，成本低廉和细胞损伤小等优点，因而更合适临床的应用，但现有常规的组织块贴壁法得到脐带间充质干细胞细胞周期较长，效率低，导致获得的原代细胞数量较少，且纯度不高，易混杂内皮细胞，不能达到MSC临床使用的国际标准，导致临床应用较为困难。
【发明内容】
[0005]为了解决前述问题，本发明提供了一种改良的组织块贴壁法。
[0006]本发明脐带间充质干细胞的分离方法，它包括如下步骤:
[0007](I)取新鲜脐带，剪短，去除血污；
[0008](2)剪碎成体积为2?3mm3的组织块，均匀平铺于包被了细胞外基质的培养皿中，在37°C、5% CO2条件下培养I?4h，然后添加间充质干细胞培养基，在37°C、5% CO2条件下继续培养；
[0009](3)在培养第5天时，对培养基进行半换液；在培养第8天时，去掉所有组织块，并对培养基进行全换液；在细胞融合度为30-40%时收获细胞，即可。
[0010]细胞外基质:存在于组织中，由细胞合成并分泌至胞外的一组蛋白质混合物，帮助细胞附着和生长，包括纤维性成分(胶原蛋白、弹性蛋白和网织蛋白)、连接蛋白(纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)和空间充填分子(主要为蛋白聚糖)等。明胶或者Cellstart基质均属于细胞外基质。
[0011]半换液:去除培养皿中一半培养基，再补充一半新鲜的培养基。
[0012]全换液:除去培养皿中所有的培养基，再补充新鲜的培养基。
[0013]优选地，步骤(I)中，所述剪短是剪为长度为I?1.5cm小片段。
[0014]优选地，步骤(I)中，所述去除血污的方法是PBS溶液清洗。
[0015]优选地,步骤(2)中,所述细胞外基质是明胶或者Cellstar基质。
[0016]其中，所述明胶的浓度为0.1?0.5% (w/v);所述Cellstart基质的浓度为1%?2% (w/v)。优选地,所述明胶的浓度为0.2% (w/v);所述Cellstart基质的浓度为2% (w/
V) O
[0017]优选地，步骤(2)中，添加培养基之前的培养时间为2h。
[0018]本发明间充质干细胞培养基可以是含血清间充质干细胞培养基或无血清间充质干细胞培养基，但动物血清带来的异源污染会为临床使用带来风险，因此，优选为无血清间充质干细胞培养基。
[0019]其中，无血清间充质干细胞培养基可以为STEMPRO MSC SFM。
[0020]本发明还提供了前述方法制备的脐带间充质干细胞。
[0021]本发明方法可以促进细胞从脐带组织中爬出，有效地提高了脐带间充质干细胞的分离效率，使得单位长度脐带组织获得间充质干细胞的数量大大提升，也可以提高脐带间充质干细胞的纯度并达到了 MSC临床使用的国际标准，能够临床使用。同时，本发明方法操作简便，成本低廉，应用前景良好。
[0022]下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
【附图说明】
[0023]图1基质浓度筛选实验结果；
[0024]图2与传统方法的比较的实验结果；
[0025]图3第5天显微镜下观察结果；左图:未包被基质实验组；右图:包被基质实验组；
[0026]图4本发明实验组第8天显微镜下观察结果；左图:去除组织块前右图:去除组织块后;
[0027]图5本发明实验组第11天显微镜下观察结果；
[0028]图6生长曲线；
[0029]图7流式细胞术检测结果；
[0030]图8体外诱导分化实验结果。
【具体实施方式】
[0031]实施例1本发明分离纯化方法
[0032]培养皿预处理:10cm细胞培养皿用Iml 0.2%明胶包被过夜，去除残留明胶；
[0033]组织块法分离脐带间充质干细胞:用眼科剪将新鲜脐带剪成Icm长度，用PBS清洗脐带血污；每Icm长度脐带剪碎至2?3_3大小组织块，并均匀平铺于培养皿中；放置370C 5% CO2条件下培养2h，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPRO MSC SFMJgg LifeTechnologies公司)1ml在相同条件下继续培养；第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30?40%时收获细胞。
[0034]实施例2本发明分离纯化方法
[0035]培养皿预处理:10cm细胞培养皿用Iml 2%的Cellstart基质包被过夜，去除残留Cellstart 基质；
[0036]组织块法分离脐带间充质干细胞:用眼科剪将新鲜脐带剪成Icm长度，用PBS清洗脐带血污；每Icm长度脐带剪碎至2?3_3大小组织块，并均匀平铺于培养皿中；放置37°C 5% CO2条件下培养2h，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPRO MSC SFM) 1ml在相同条件下继续培养;第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30?40%时收获细胞。
[0037]实施例3本发明分离纯化方法
[0038]培养皿预处理:10cm细胞培养皿用Iml 0.1 %明胶包被过夜，去除残留明胶；
[0039]组织块法分离脐带间充质干细胞:用眼科剪将新鲜脐带剪成1.5cm长度，用PBS清洗脐带血污；每1.5cm长度脐带剪碎至2?3mm3大小组织块，并均匀平铺于明胶预处理的培养皿中；放置37°C 5% CO2条件下培养2h，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPRO MSCSFM) 1ml在相同条件下继续培养；第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30?40%时收获细胞。
[0040]实施例4本发明分离纯化方法
[0041]培养皿预处理:10cm细胞培养皿用Iml 0.5%明胶包被过夜，去除残留明胶；
[0042]组织块法分离脐带间充质干细胞:用眼科剪将新鲜脐带剪成Icm长度，用PBS清洗脐带血污；每Icm长度脐带剪碎至2?3_3大小组织块，并均匀平铺于培养皿中；放置370C 5% CO2条件下培养lh，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPRO MSC SFM) 1ml在相同条件下继续培养;第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30?40%时收获细胞。
[0043]实施例5本发明分离纯化方法
[0044]培养皿预处理:10cm细胞培养皿用Iml 1% Cellstart基质包被过夜，去除残留Cellstart 基质；
[0045]组织块法分离脐带间充质干细胞:用眼科剪将新鲜脐带剪成Icm长度，用PBS清洗脐带血污；每Icm长度脐带剪碎至2?3_3大小组织块，并均匀平铺于培养皿中；放置370C 5% CO2条件下培养4h，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPRO MSC SFM) 1ml在相同条件下继续培养;第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30?40%时收获细胞。
[0046]实施例6基质浓度筛选试验
[0047]1、实验方法
[0048]培养皿预处理:10cm细胞培养皿分别用Iml I %的Cellstart基质、0.2 %的Cellstart基质、0.2%的明胶包被过夜，去除残留基质；对照组不包被基质。
[0049]组织块法分离脐带间充质干细胞:用眼科剪将新鲜脐带剪成Icm长度，用PBS清洗脐带血污；每Icm长度脐带放置在明胶包被的培养皿中，添加Iml胎牛血清后将脐带剪碎至2?3_3大小组织块并均匀平铺于培养皿中；放置37°C 5% CO2条件下培养2h，然后添加间充质干细胞培养基(LG-DMEM/F12及10%胎牛血清)1ml继续在相同条件下培养；第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；第11天收获细胞并进行细胞计数。
[0050]2、实验结果
[0051]如图1所示,预先用0.2%明胶或者0.2?I %的Cellstart基质处理1cm细胞培养皿后，能够明显提升原代细胞数量；其中1% cellsart预处理效果最好。
[0052]本发明方法中，细胞外基质可以为明胶或者Cellstart基质，优选为Cellstart基质。
[0053]以下用实验例的方式说明本发明的有益效果:
[0054]实验例I与传统方法的比较
[0055]1、试验方法
[0056]培养皿预处理:
[0057]未包对照组:未包被任何基质；
[0058]明胶包被实验组:明胶(0.2