米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种米曲霉尿嘧啶营养缺陷型筛选的方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]丝状真菌米曲霉生长迅速、易于培养，并且有很高的蛋白质分泌能力，能够正确进行各种翻译后加工，并且与高等真核生物类似。米曲霉又是公认的食品安全生产菌株，发酵及后处理技术成熟，因此它除了在发酵工业中被用于生产初级、次级代谢产物及酶类产品夕卜，常常成为进行基因表达和蛋白分泌研究的理想对象为了将待表达的基因导入米曲霉中，首先需要建立一个稳定有效的基因转化系统。建立米曲霉基因转化系统主要从受体细胞、遗传转化法和选择性标记选择等方面考虑。米曲霉坚硬的细胞壁是遗传转化的主要障碍，所以转化时一般以原生质体作为受体细胞，制备原生质体的材料包括幼嫩菌丝、分生孢子和担孢子。通常用于米曲霉遗传转化的方法有PEG/CaC12法、电击转化及基因枪转化法等，其中PEG/CaC12法由于操作难度小、原生质体做为受体细胞具有群体数量大、容易获得纯合性转化子的特点最为常用；电击法虽操作简便，但转化效率比较低;基因枪法的优势在于操作迅速、简单及受体材料广泛且不需制备原生质体，但其价格昂贵、转化率低、嵌合体不易排除，因此对于米曲霉采用后两种方法的研究比较少。米曲霉转化的选择性标记有3类:营养缺陷型标记基因、药物抗性标记基因及功能标记基因，其中营养缺陷型互补基因转化系统以其低背景生长的特性相比于其他系统更为有效以乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因(PyrG)作为选择标记并以该基因的缺陷株真菌作为受体的转化系统在国外己被证明是一种十分有效的基因转化系统。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选方法，能够快速的获得大量的米曲霉营养缺陷型菌株，并且遗传稳定性强，为米曲霉菌株转化系统的进行奠定了技术基础。
[0004]具体技术方案:
[0005]—种米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选方法，包括如下步骤:
[0006](I)将5mL总数量为5 X 17个通过5μπι针头过滤器的新鲜米曲霉孢子置于直径为6cm的平皿中进行紫外诱变;诱变条件为:诱变波长254nm，诱变高度16cm，诱变时间1.5min，磁力搅拌器转速400r/min;
[0007](2)把诱变的分生孢子涂布在培养基I上；
[0008]所述培养基I配制方法为:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，FeScn0.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.58，1^^01^-1000.078，5-氟乳清酸(5冲0八)1.58，尿嘧啶核苷2.48，琼月旨20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌备用；
[0009](3)在30°C条件下培养7?10d，挑选出能够抗5-F0A的单菌落;将单菌落转移至培养基2斜面；
[0010]所述培养基2配制方法为:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，FeScn0.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，Trit1nx-1000.07g，肌醇2g，5-F0A I.5g，尿嘧啶核苷2.4g，琼脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌备用；
[0011](4)收集斜面上的米曲霉孢子，涂布在培养基I平皿上；
[0012](5)将平皿上长出的米曲霉单菌落分别对点到培养基3和培养基4上;收取在培养基3上不能生长，在培养基4上生长的菌株即为米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株；
[0013]所述培养基3的配制方法为:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，FeSo40.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，琼脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌备用；
[0014]所述培养基4的配制方法为:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，FeSo40.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，尿嘧啶核苷2.4g，琼脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌备用。
[0015]步骤(4)收集斜面上的米曲霉孢子，通过3μπι针管过滤器后，涂布在培养基I平皿上
[0016]本发明有益效果:采用本发明方法，能够快速的获得大量的米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，并且遗传稳定性强，为米曲霉菌株转化系统的进行奠定了技术基础。
【附图说明】
[0017]图1本发明获得的培养4天后的米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。
【具体实施方式】
[0018]如无具体说明，本发明的各种原料均可由市场销售得到；或者根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明，本文中所使用的专业术语与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同，此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0019]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国家标准、常规条件、或按照制造商所建议的条件进行。
[0020]实施例1
[0021](I)将5mL总数量为5 X 17个通过5μπι针头过滤器的新鲜米曲霉孢子置于直径为6cm的平皿中进行紫外诱变，诱变条件(诱变波长254nm，诱变高度16cm，诱变时间1.5min，磁力搅拌器转速400r/min，)；
[0022 ] (2)把诱变的分生孢子涂布在培养基I上；
[0023]所述培养基I配制方法为:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，FeScn0.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g,Trit1nx-1000.07g,5-F0A 1.5g，尿嘧啶核苷2.4g，琼脂20g，加至100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌；
[0024](3)在30°C条件下培养7?10d，挑选出能够抗5-F0A的单菌落;将单菌落转移至培养基2斜面；
[0025]所述培养基2配制方法为:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，FeScn0.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，Trit1nx-1000.07g，肌醇2g，5-F0A I.5g，尿嘧啶核苷2.4g，琼脂20g，加至100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌；
[0026](4)收集斜面上的米曲霉孢子，通过3μπι针管过滤器后，涂布在培养基I平皿上；
[0027](5)将平皿上长出的米曲霉单菌落分别对点到培养基3和培养基4上;收取在培养基3上不能生长，在培养基4上生长的菌株即为米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株；
[0028]所述培养基3的配制方法为:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，FeSo40.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，琼脂20g，加至100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌；
[0029]所述培养基4的配制方法为:葡萄糖20g，NaNo32g，K2HPo4lg，FeSo40.lg,Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，尿嘧啶核苷2.4g，琼脂20g，加至100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌。
[0030]培养4天的米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株见图1。
[0031]本发明方法能够快速获得尿嘧啶营养缺陷型米曲霉菌株;本发明获得的尿嘧啶营养缺陷型米曲霉经20次传代后仍然保持尿嘧啶营养缺陷型性状，具有较高的遗传稳定性。
【主权项】
1.一种米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将5mL总数量为5X17个通过5μπι针头过滤器的新鲜米曲霉孢子置于直径为6cm的平皿中进行紫外诱变;诱变条件为:诱变波长254nm，诱变高度16cm，诱变时间1.5min，磁力搅拌器转速400r/min; (2)把诱变的分生孢子涂布在培养基I上； 所述培养基I配制方法为:葡萄糖20g，NaNo3 2g ,K2HP04 lg，FeSo4 0.1g ,Kcl 0.5g,MgSo4.7H20 0.5g，Trit1nx-100 0.07g，5-氟乳清酸I.5g，尿嘧啶核苷2.4g，琼脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌备用； (3)在30°C条件下培养7?10d，挑选出能够抗5-F0A的单菌落;将单菌落转移至培养基2斜面； 所述培养基2配制方法为:葡萄糖20g，NaNo3 2g ,K2HP04 lg，FeSo4 0.1g ,Kcl 0.5g,MgSo4.7H20 0.5g,Trit1nx-100 0.07g，肌醇2g，5-氟乳清酸1.5g，尿嘧啶核苷2.4g，琼脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌备用； (4)收集斜面上的米曲霉孢子，涂布在培养基I平皿上； (5)将平皿上长出的米曲霉单菌落分别对点到培养基3和培养基4上;收取在培养基3上不能生长，在培养基4上生长的菌株即为米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株； 所述培养基3的配制方法为:葡萄糖20g，NaNo3 2g，K2HPo4 lg，FeSo4 0.1g，Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，琼脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌备用； 所述培养基4的配制方法为:葡萄糖20g，NaNo3 2g，K2HPo4 lg，FeSo4 0.1g，Kcl 0.5g，MgSo4.7H20 0.5g，尿嘧啶核苷2.4g，琼脂20g，溶于100mL水中，pH 6.6，115°C，20min灭菌备用。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于步骤(4)收集斜面上的米曲霉孢子，通过3μπι针管过滤器后，涂布在培养基I平皿上。
【专利摘要】本发明属于生物工程领域，公开了一种米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选方法，具体为将米曲霉孢子诱变；把诱变的分生孢子涂布在培养基1上；在30℃条件下培养7～10d，挑选出能够抗5-FOA的单菌落；将单菌落转移至培养基2斜面；收集斜面上的米曲霉孢子，涂布在培养基1平皿上；将平皿上长出的米曲霉单菌落分别对点到培养基3和培养基4上；收取在培养基3上不能生长，在培养基4上生长的菌株即为米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。能够快速的获得大量的米曲霉营养缺陷型菌株，并且遗传稳定性强，为米曲霉菌株转化系统的进行奠定了技术基础。
【IPC分类】C12N1/02, C12N13/00, C12R1/645
【公开号】CN105524914
【申请号】CN201511004106
【发明人】曾斌, 郝庆, 刘华
【申请人】江西科技师范大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年12月29日