桃PpeAMT1;1基因、转运蛋白、表达载体及其构建方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及桃PpeAMTI; 1基因、转运蛋白、表达载体及其构建方法，属于分子生物 学和生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 铵离子(NH4+)是最主要的无机氮存在形式，是植物优先吸收的氮素营养，与植物的 生长、发育和果实品质密切相关。铵肥在促进果实品质与产量等生理方面起重要作用，施用 适量铵肥不仅可以显著地增强果实的内在品质，也可以改善了果实的外观品质。然而，相关 报道主要集中在生理生化层面，有关果实品质、产量与NH4+的吸收、转运及其代谢的分子机 理的报道鲜少。
[0003] 植物对NH4+的吸收是依赖定位于细胞质膜上的AMT转运体来实现完成的，分为AMT1 和AMT2两个基因亚族。Ninnemann等从拟南芥中克隆并鉴定了第一个植物AMT1成员基因，迄 今为止，关于该类基因结构与功能的报道主要集中在一年生草本植物拟南芥、番茄、百脉 根、油菜和水稻等为研究材料。报道显示AMT1基因主要在一年生植物体的根部表现出高表 达，主导根部NH4+的吸收（Preferential expression of an ammonium transporter and of two putative nitrate transporters in root hairs of tomato，Lauter FR， Ninnemann 0,Bucher M，Riesmeier JW，Frommer WB，Proc·Natl·Acad·Sci·USA;Three functional transporters for constitutive,diurnally regulated,and starvation-induced uptake of ammonium into Arabidopsis roots，Gazzarrini S，Lejay L，Gojon A,Ninnemann 0，Frommer WB，Plant Cell;Differential regulation of three functional ammonium transporter genes by nitrogen in root hairs and by light in leaves of tomato，von Wiren N，Lauter FR，Ninnemann 0，Gillissen B，Walch_Liu P，Engels C，Jost W，Formmer WB，Plant Journal^Functional characterization of an ammonium transporter gene from Lotusjaponicas,Salvemini F，Marini AM，Riccio A， Patriarca EJ,Chiurazzi M，Gene;Distinct expression and function of three ammonium transporter genes(OsAMTl；1-1；3)in rice,Sonoda Y，IkedaA，Saiki S，von Wir6n N，Yamaya T，Yamaguchi J，Plant Cell Physiol)，或主要在叶片表达，主导地上部 的车专运（Functional characterization of an ammonium transporter gene from Lotus japonicas，Salvemini F，Marini AM，Riccio A，Patriarca EJ，Chiurazzi M，Gene; Characterization of three functional high-affinity ammonium transporters in Lotus japonicus with differential transcriptional regulation and spatial expressionjD'Apuzzo E,Rogato A,Simon-Rosin U,E1 Alaoui H，Barbulova A，Betti M， Dimou M，Katinakis P，Marquez A，Marini AM,Udvardi MK,Chiurazzi M,Plant Physiology) ^然而，植物AMT1家族基因成员的功能尚未完全清楚，AMT家族基因在果实发 育及品质形成的具体功能及其调控机制更是未知的。由于木本植物具有多年生长的特性， 具有与草本植物截然不同的氮素吸收转运特点，它们的AMT同源基因调控方式与生理功能 亦有所差别，因此，从木本植物果实中分离并鉴定新的AMT同源基因具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明首次公开了从桃果实中分离出的铵转运体PpeAMTl; 1基因的全长CDNA，并 提供一种高效表达桃AMT基因的酵母表达载体构建方法。
[0005] 本发明公开了一种桃PpeAMTl ;1基因，其碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0006] 本发明还公开了上述桃PpeAMTl;l基因编码的转运蛋白，其序列如SEQ ID N0:2所 不。
[0007] 本发明还公开了上述桃PpeAMTl; 1基因表达载体pYES2-PpeAMTl; 1，其特征在于载 体为PYES2质粒，基因为SEQ ID N0:1所示的基因。
[0008] 本发明还公开了上述桃PpeAMTl; 1基因表达载体PpeAMTl; 1的构建方法，其步骤包 括：
[0009] A、通过PCR方法扩增目的基因片段，并回收PCR产物，其中PpeAMT 1; 1基因5'端引物 的喊基序列如SEQ ID N0:3所不，PpeAMTl;l基因3端引物的喊基序列如SEQ ID N0:4所不；
[0010] B、分别用Κρη I和Not I双酶切PCR回收产物和pYES2质粒，然后用T4DNAligase连 接，获得表达载体pYES2-PpeAMTl; 1。
[0011] 本发明通过同源克隆方法从桃中克隆得到一个1515bp的片段，BLAST显示与其他 作物的AMT 1家族成员具有较高的同源性，氨基酸序列具有1个典型的ammo n i um transporter功能域，包括12个跨膜区，可推断其为一个新的桃铵转运体PpeAMTl; 1基因。实 时定量PCR结果表明，该基因在幼果形成及果实发育初期的表达水平最高，显著高于一年生 叶、韧皮部、花和根部的表达水平，而在果实成熟时期的表达水平较低，推测其主要在果实 发育过程中起作用。为了进一步了解AMT1;1基因功能，将其连接到酵母表达载体pYES2上， 构建成重组质粒pYES2-PpeAMTl; 1，并转化酵母菌31019b突变体(MATa meplAmep2A :: LEU2 mep3A: :KanMX2 ura3,由于缺失了吸收和转运NH4+的位点，在外界NH4+作为唯一氮源 且浓度低于5mmol I/1时不能生长）。结果发现，该重组质粒能恢复酵母突变体的生长，表明 PpeAMTl;l基因具有吸收外界NH4+的能力，为进一步探讨AMT1家族基因在桃果实发育中NH4+ 的吸收、转运和调控机制提供了方便和可能。
【附图说明】
[0012]图1为实施例1中桃、水稻、拟南芥、番茄和百脉根的AMT1;1蛋白氨基酸同源性比 对图。图注：PpeAMTl; 1:桃AMT1; 1 ;0sAMTl; 1:水稻AMT1; 1 ;AtAMTl; 1:拟南芥AMT1; 1; LeAMTl; 1:番茄AMT1; 1; LjAMTl; 1:百脉根AMT1; 1; Consensus:氨基酸序列一致性。
[0013] 图2为实施例2中桃PpeAMTl ;1基因在不同组织或器官的实时荧光定量RT-PCR表达 图。图注:S1，发育时期1 (第一次果实快速发育期）；S2，发育时期2(硬核期）；S3，发育时期3 (果实膨大期）；S4,发育时期4(果实成熟期）。
[0014]图3为pYES2-PpeAMTl; 1表达载体的构建方法示意图。
[0015] 图4为实施例3中pYES2-PpeAMTl; 1重组表达载体的酶切验证图。
[0016]图5为实施例4中酵母在不同对原条件下的生长状态图。
【具体实施方式】
[0017] 下面对本发明作进一步说明。
[0018] 实施例1:桃果实基因的克隆方法
[0019] 1、果实总RNA的提取：
[0020] (1)取lmL CTAB提取液分装到2mL离心管中，65°C预热；
[0021] (2)称取0.5g桃果实材料，在液氮中研磨后立即转入含有CTAB提取液的离心管中， 涡旋混合，65°C温浴5min;
[0022] (3)立即加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，祸旋混合，室温，12000rpm离心10min;
[0023] (4)吸取上清到一新的离心管中，重复步骤3;
[0024] (5)取上清到一新的离心管中，加入1/3体积的8M LiCl，4°C沉淀过夜；
[0025] (6)4°C，12000rpm离心 20min;
[0026] (7)弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤；
[0027] (8)将沉淀溶解在