拟南芥抗病相关基因AtIAA17及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种增强植物对病原菌Pst DC3000抗性的AtIAA17基因，同时还涉及一种拟南芥抗病相关基因 AtIAA17的制备方法及其 抗病应用。
【背景技术】
[0002] 植物经常面临着种类繁多的病原微生物的侵染，这些病害侵染是植物生活史中不 可避免的不利因素。然而，植物由于自身不能移动，当遭受逆境环境时只能应答外界胁迫， 从而在与病原微生物的长期协同进化过程中，进化出一系列复杂而精密的调控机制，来感 受外部胁迫并传递信号，从而能抵御大多数病原微生物的侵染。一方面植物体本身的细胞 结构及细胞壁包含的较厚角质层和木质素等可以在一定程度上抵御外来病原菌的侵染;另 一方面当外来病原菌侵染植物时，植物体内会通常被诱导产生超敏反应，被病原菌侵染的 部位通过产生超敏反应诱导细胞死亡，以阻止病原菌对植物的进一步侵染，同时由于细菌 的侵染还可使植物体未受侵染的部位会产生系统获得抗性。
[0003] 根据植物免疫系统的研究现状，人们把病原菌与植物的相互作用分成了四个阶 段:在第一个阶段，植物的模式识别受体可以识别病原微生物保守的病原相关分子模式，从 而激活植物引发相应的免疫反应，而使大多数的病原微生物不能致病;在第二个阶段，部分 进化的病原微生物可以分泌毒性因子，从而导致植物产生出相应的效应因子激活的感病 性;在第三个阶段，植物进化出特异的R基因识别病原微生物的因子，产生相应的效应因子 激活的免疫反应;在第四个阶段，在长期的自然选择和进化中病原微生物会不断产生新的 致病效应因子，同时植物也会在进化过程中产生新的R基因以使自己在与病原菌的互作中 生存下来。
[0004]植物的抗性一般包括基础抗性(也即植物体内的最基本的自然抗性），系统获得抗 性(也即上面所到的当病原菌侵染时，由于细菌的侵染可使植物体未受侵染的部位会产生 的抗性），诱导性抗性(与系统获得抗性所不同的是，它不是由病原菌所诱导的，而是由类似 根瘤菌等真菌类所诱导的）。植物的基础抗性是植物体内的最基本的自然抗性;外来病原菌 侵染植物时，植物体内会通常被诱导产生超敏反应，被病原菌侵染的部位通过产生超敏反 应诱导细胞死亡，以阻止病原菌对植物的进一步侵染，同时由于细菌的侵染还可使植物体 未受侵染的部位会产生系统获得抗性，进而保护植物的生长。而丁香假单胞杆菌是一种研 究植物对病原细菌的模式细菌，利用有毒的菌株可直接分析植物的基础抗性;而含有R蛋白 的无毒菌株与有毒菌株综合利用，则可以分析植物的系统获得抗性。
[0005] 在全球气候(温度升高和降水格局)变化条件下，各种环境胁迫单独或联合的作用 将导致作物大幅度减产，并引发自然生态系统退化。病原菌对世界作物产量的危害很大，已 成为制约农业发展的一个重要问题。研究植物抗病机制，从而提供提高植物抗病性的各种 措施或直接培育抗病品种，显然意义重大。
[0006] 目前，国际上很多研究小组从正向遗传学和反向遗传学多个方向在植物抗病机理 的研究中取得了较大的研究进展，已经在拟南芥、水稻、大豆和棉花等高等植物中陆续分离 了一些抗性基因，这类基因广泛参与调控植物抗病性。因此，探究植物对病原菌的抗性机 制，发现新的抗性基因具有深远意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供了一种增强植物对病原菌Pst DC3000抗性的拟南芥 AtIAA17基因，该基因的组成型表达可以增强植物对病原菌Pst DC3000的抗性，从而应用于 抗性育种。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供了一种拟南芥AtIAA17基因的制备方法，该方法易 行，操作简便，根据SEQ ID No.l所示核苷酸序列，获得AtIAA17基因全长序列的电子克隆 后，应用简单的PCR方法即可以获得该基因的序列。
[0009] 本发明的再一个目的在于提供了一种拟南芥AtIAA17基因在增强植物对病原菌 Pst DC3000抗性中的应用。拟南芥AtIAA17基因的超表达显著增强了植物对病原菌Pst DC3000的抗性。
[0010] 为了实现本发明的上述目的，发明人通过大量试验研究并探索，最终获得了如下 技术方案：
[0011] -种从拟南芥中分离的AtIAA17基因，其序列为SEQ ID No.l所示的核苷酸序列， 或者是SEQ ID No.l所示的核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获 得的保守性变异体。
[0012]需要说明的是，本发明同时还提供了所述AtIAA17基因的表达载体;进一步优选该 表达载体是PBARN质粒载体。另外，本发明还提供了含有上述表达载体的细胞;进一步优选 该细胞是大肠杆菌DH5a或根癌农杆菌GV3101。
[0013]另一方面，本发明提供一种拟南芥AtPED2基因的制备方法，该方法的步骤包括:在 液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒进行RNA的提取。提取的总 RNA溶于无 RNase的双蒸水中，采用DNase I去除可能残留的DNA。以获得的RNA为模板进行逆 转录，得到的cDNA分装后于-20°C保存备用。根据拟南芥公共数据库TAIR(http:// ?〇￥界.&1&13丨(1〇口8丨8.〇作/)中拟南芥六1：]^六17基因序列（六1:18〇4250)，在该基因003((]〇(1;[1^ sequence，编码序列，以下相同）起始密码子和终止密码子同源区域设计引物(序列为?_5'_ GAAGGTATCAATGGACGGAGCA-3'，R-5'-CCGACGAGCATCCAATCACC-3'），从而确保扩增产物为全 长序列。以拟南芥的叶片的cDNA为模版，进行PCR扩增，回收并纯化扩增的PCR产物。PCR反应 体系为：l0XTaq酶反应缓冲液2μ1、25πιΜ MgCL2 1·2μ1、2πιΜ dNTP 1·5μ1、10μΜ引物0·2μ1、 0.3单位 Taq 酶，加无菌水至20μ1。反应程序为:94°C 变性 5min，94°C45s、55°C45s、72°C2min 32循环，72°C延伸5min。
[0014]与现有技术相比，本发明涉及的AtIAA17基因具有以下如下优点和有益效果：
[0015] (1)通过克隆该基因，研究该基因在植物抗病原菌Pst DC3000中的作用，明确了该 基因具有增强植株对病原菌Pst DC3000抗性的功能。通过该基因的过表达，研究人员可以 人工创造抗性增强材料，为实现抗性分子育种提供新的抗性基因。
[0016] (2)通过构建该基因的超表达载体(35SpBARN-AtIAA17)，转化拟南芥，获得有效的 超表达(35SpBARN-AtIAA17)转基因植株，为研究拟南芥相关基因功能提供了一个有效的方 法。
[0017] (3)通过比较35SpBARN-AtIAA17超表达株与野生型拟南芥的抗病性，发现 35SpBARN-AtIAA17超表达株在病原菌Pst DC3000侵染后叶片的细菌数目是野生型拟南芥 的20 %左右。
[0018] 综上所述，本发明涉及的AtIAA17基因可以增强植物对病原菌Pst DC3000的抗性， 尤其是首次通过基因工程技术升高AtIAA17基因的表达，发现其能够增强植物对病原菌Pst DC3000的抗性，因此可作为基因工程的候选基因用于分子育种。
【附图说明】
[0019] 图1为AtIAA17基因超表达载体35SpBARN-AtIAA17的构建示意图。
[0020] 图2为AtIAA17基因超表达转化株中，AtIAA17基因的表达水平图。结果显示两个 AtIAA17基因超表达转化植株中AtIAA17基因的相对表达水平显著高于野生型植株。
[0021] 图3为AtIAA17基因超表达转化株和野生型植株的对病原菌Pst DC3000抗性鉴定 图。图中表示28天的野生型植株和两个AtIAA17基因超表达转化植株在病原菌Pst DC3000 侵染3天后叶片的细菌数目统计。
【具体实施方式】
[0022] 以下结合具体实施例对本发明做出更详细的描述。根据以下的描述和这些实施 例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征。并且，在不偏离本发明精神和范围的前提 下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
[0023] 实施例1:拟南芥AtIAA17基因的制备
[0024] 在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒（购自 Invitrogen公司，以下相同）的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无 RNase的双蒸水中。 DNase I(购自Promega公司，以下相同）去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪（DM 650 BECKMAN，MSA)分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合1 % (质量体积比）琼脂糖 凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板进行逆转录，得到的cDNA分装后于-20 °C保存备用。
[0025] 根据拟南芥公共数据库 TAIR(http: //www.arabidopsis .org/)中拟南芥 AtIAA17 基因序列(Atlg04250)，在该基因基因 CDS(Coding sequence，编码序列，以下相同）起始密 码子和终止密码子同源区域设计引物(序列为F-5 ' -GAAGGTATCAATGGACGGAGCA-3 '，R-5 ' -CCGACGAGCATCCAATCACC-3'），从而确保扩增产物为全长序列。以拟南芥的叶片的cDNA为模 版，进行PCR扩增，回收并纯化扩增的PCR产物。PCR反应体系为：10 X Taq酶反应缓冲液2μ1、 25mMMgCL2 1·2μ1、2πιΜ dNTP 1·5μ1、10μΜ引物0·2μ1、0·3单位Taq酶，加无菌水至20μ1。反 应程序为:94°C变性5min，94°C45s、55°C45s、72°C2min 32循环，72°C延伸5min(以下相同）。
[0026] 实施例2:拟南芥抗病相关基因 AtIAA17的过表达植株的获得
[0027] l、AtIAA17基因超表达载体(35SpBARN-AtIAA17)的构建和根癌农杆菌菌株GV3101 转化：
[0028] 构建的重组载体是将已构建的质粒pBARN(LeClere S，