一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物基因工程领域，涉及建立一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转 移系统以及基于此基因转移系统介导的禽类转基因方法。
【背景技术】
[0002] 转座子是一类在基因组上可以自由跳跃(复制或移位）的DNA序列，由Mc.Clintock 于1940年首先在玉米中发现，以后又陆续在细菌、真菌及昆虫等各种生物中发现。近年来， 转座子系统已经应用于非病毒介导的转基因，尤其是转基因哺乳动物方面。但在转基因禽 类制备方面，基于禽类特殊的生理生殖特点，即：胚胎的早期发育在母禽的生殖系统就已启 动，因而即使是刚产出的蛋，也已发育成具有约60000个形态上未分化的全能细胞的胚盘 (位于囊胚腔），以及禽类受精卵和早期胚胎具有硕大的卵黄、难以直接进行基因操作等原 因，禽类转基因技术一直落后于其它动物。
[0003] 转基因禽类制备具有繁殖周期短、生产性能高、研究成本较低等优点，其输卵管是 生产蛋白质的天然"发酵罐"。近年来禽蛋生物反应器以其自身的优势和不可限量的前景渐 渐成为一个新的研究热点。其中，转基因鸡制备主要集中于病毒侵染X期胚盘、体外或体内 转染PGCs等方法。这些方法虽然取得了一定成果，但仍然存在转基因效率不高、基因表达抑 制和基因沉默现象以及生物安全性等问题，所以转基因禽类的制备一直以来都缺少一种有 效的、非病毒介导的基因转化系统。转座子介导技术的使用，提高了外源基因在鸡基因组的 整合效率，展示了制备转基因禽类的前景。常用的转座子系统有鲑鱼SB( Sleeping beauty)、PB(PiggyBac)、Tol2等，都是根据"切割-黏贴"的方式进行转座，可以有效地提高 转基因动物制备效率，但转座子系统不具有生殖细胞特异性，其在体细胞和生殖细胞中基 因转移率相当，所以转基因后代仍存在嵌合体多、性腺基因转移效率低下等问题。
[0004] 原始生殖细胞(PGCs)是精子和卵子的前体细胞，在PGCs生殖质中含有线粒体16S rRNA和Vasa、0ska、Tudor基因蛋白。Vasa是生殖发育调控重要的基因之一，在胚胎发育过程 中只在性腺组织中表达，具有组织特异性。Vasa的同源物也在包括鸡在内的很多物种中证 实：Naoki Tsunekawa等（Naoki Tsunekawa,Mitsuru Naito,Yasuhiro Sakai ,Takao Nishida and Toshiaki Noce,Isolation of chicken vasa homolog gene and tracing the origin of primordial germ cells.Development,2000,127:2741-2750)发现了生殖 系特异表达的鸡的vasa同源基因 CVH(chicken vasa homologue)蛋白贯彻整个鸡胚发育期 及成年睾丸和卵巢中，表明了CVH与鸡胚生殖系的发育相关；同时Minematsu等（ΤΑΚΕ0 MINEMATSU,TAKASHI HARUMI,AND MITSURU NAITO,Germ Cell-Specific Expression of GFP Gene Induced by Chicken vasa Homologue(Cvh)Promoter in Early Chicken Embryos.MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT,2008,75:1515-1522)也通过直接将 不同长度CVH启动子体内、体外转染鸡胚生殖细胞的实验，验证了该vasa同源基因 CVH的生 殖细胞特异性，且得出了 "增强基因表达需要CVH基因5'侧翼区序列长度至少为1555bp"的 结论。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种特异性强、基因转移效率高的特异于禽类原始生殖细 胞(PGCs)的基因转移系统及方法。本发明的发明理念是:构建特异于禽类PGCs的基因转移 系统，该基因转移系统的转座酶辅助质粒含有vasa启动子，由vasa启动子驱动转座酶，利用 vasa启动子能够在PGCs中特异表达的特性，实现转座酶在PGCs中的特异性表达，从而使得 该基因转移系统的转座子供体质粒所携带的目的基因表达盒在PGCs特异性切割整合，由此 提高转座子介导目的基因（如：报告基因或者外源基因等）在PGCs的基因转移特异性和效 率;此外，可以在该基因转移系统的启动子前增加通用增强子元件（即无组织特异性的增强 子元件，如SV40 )，进一步驱动转座酶在PGCs中高效特异表达；转染禽类早期胚胎血液中 PGCs细胞，实现外源基因在禽类胚胎PGCs基因组中高效特异整合，从而提高转基因禽的制 备效率，推动转基因禽研究进展。
[0006] 为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 本发明提供了一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统，其特征在于，包括 转座子系统，所述转座子系统包括转座子供体质粒和转座酶辅助质粒，其中，所述转座酶辅 助质粒含有具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的vasa启动子。
[0008] 为了达到更高的基因转移效率，所述转座酶辅助质粒还含有通用增强子元件（即 无组织特异性的增强子元件）；优选地，所述通用增强子元件为具有如SEQ ID No.2核苷酸 序列所示的SV40增强子元件。
[0009] 所述转座子系统可以为SB转座子系统，也可以是PB、Tol2和ZB等常用转座子系统。 [0010]所述转座子供体质粒可以是PT3-PST，包括ro、SB、Tol2转座子两侧末端重复序列 和Mscl克隆位点，克隆位点可插入需要转移的目的基因表达盒。
[0011] 所述目的基因盒可以是报告基因表达盒，或者其它外源基因表达盒。
[0012] 优选地，所述转座子系统为SB转座子系统时，转座酶质粒包括SB100X转座酶cDNA 序列。
[0013] 优选地，在转染上述特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统时，使用可调节气 体压力的玻璃毛细管细针进行显微注射。该方法操作简单快捷、效率高、实验重复性好。相 比之下，禽胚注射通常采用口吸管注射法或显微操作仪，这两者对操作者技术水平要求较 高。口吸管法显微注射剂量受人为因素影响较大，导致实验重复性较差;显微操作仪价格昂 贵，操作难度较大。
[0014] 本发明还提供了一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移方法，其特征在于，包 括以下步骤：
[0015] (1)使用生物工程方法，构建如上所述的含有vasa启动子或者含有vasa启动子和 通用增强子元件的转座酶辅助质粒；
[0016] (2)使用生物工程方法，构建含有需要转移的目的基因表达盒的转座子供体质粒；
[0017] ⑶提取质粒后，将步骤⑵中所得的转座子供体质粒和步骤⑴中所得的转座酶 质粒按1:2比例混合均匀，调整其终浓度为500ng-1.5ygAiL;
[0018] (4)将步骤(3)中所得的混合质粒使用包埋剂包裹后，转染禽类早期胚胎血液中 PGCs细胞，从而使得转座酶仅在PGCs细胞特异表达，提高嵌合体禽类生殖系转基因效率。
[0019] 优选地，步骤(4)中所述的包埋剂为多聚乙烯亚胺(PEI)。
[0020] 本发明所达到的技术效果是：
[0021 ] 1)本发明构建了具有PGCs特异表达特性的基因转移系统，该系统包括含有vasa启 动子的转座子系统，vasa启动子是生殖细胞特异启动子，能够指导下游基因在生殖细胞特 异的表达;此外，在启动子前增加的通用增强子元件，可以进一步实现转座酶在PGCs中高效 特异表达；
[0022] 2)本发明所提供的基因转移系统，特异于禽类PGCs，可以从基因表达特异性和强 度方面有效地提高转座子介导外源基因在PGCs的基因转移效率，从而更有效地提高转基因 禽类制备效率；
[0023] 3)本发明提供的基于转座子系统的基因转移方法，操作简单快捷、实验重复性好， PGCs特异性强，生殖系基因转移效率高。经过胚胎水平验证，该方法能够高效介导基因转染 PGCs，因而可应用于多个生物技术领域:例如，a)使用本发明中给出的方法可有效地将目的 基因盒整合到宿主PGCs基因组中，提高禽类胚胎生殖系转基因效率，显著提高禽类转基因 效率;b)可以应用于制备转基因禽类生物反应器，在蛋清中生产人源珍贵药用蛋白。
【附图说明】
[0024] 图1是PCR扩增vasa启动子产物电泳图。