一种罗氏海盘车抗菌多肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肽的制备，尤其是一种罗氏海盘车抗菌多肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]我们知道，生物活性肽就是对生物机体的生命活动有益或是具有生理作用的肽类化合物，是一类相对分子质量小于6000Da，是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，小至由两个氨基酸组成，大至由数十个氨基酸通过肽键连接而成。现有的研究表明，肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。
[0003]在生物活性肽领域有一种抗菌多肽，这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。
[0004]罗氏海盘车(Asierias rollestoni)，俗称海星、五角星，为海星纲棘皮动物，多栖息在潮间带的沙或石砾底，其含有脂类、多糖、多肽及氨基酸、胶原蛋白、皂苷、留醇、生物碱等多种营养成分和活性物质，罗氏海盘车含有丰富的蛋白质(15.46%)，蛋白质含量比海胆黄和海参的都高，所含氨基酸种类齐全，其中必需氨基酸占氨基酸总量47.33%，因此罗氏海盘车可谓是一种优质蛋白源。目前，对罗氏海盘车的开发利用还十分局限，主要集中在皂苷和多糖类的研究上，还没有发现从罗氏海盘车的蛋白酶解产物中分离具有抗菌活性多肽的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供了一种工艺先进、步骤合理、操作可行的罗氏海盘车抗菌多肽的制备方法。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种罗氏海盘车抗菌多肽的制备方法，其特征在于:其经过下列工艺步骤:
(1)原料预处理
选取新鲜的罗氏海盘车为原料，用水清洗，切成块状后送入匀浆机中，制得罗氏海盘车匀浆液；
(2)蛋白酶解产物的制备
将步骤(I)中得到的罗氏海盘车匀浆液加入与其等重量的超纯水，搅拌均匀，再加入2?5% (以底物蛋白含量计，w/w%)海产品水解酶，调整pH值至7.0?8.5，控制温度40?60°C，水解3?5h;水解后加热至90?100°C，保持5?15min灭酶，得酶解液;将酶解液离心，得酶解上清液；
(3)浓缩、干燥
将步骤(2)中得到的酶解上清液进行真空浓缩至固形物含量为15?30%，冷冻干燥，得固体粉末；
(4)去多糖
将步骤(3)中得到的固体粉末重新溶解于去离子水中，然后加入无水乙醇至乙醇终浓度为70?90%，静置过夜，离心去除多糖沉淀，留取去沉淀的上清液；
(5)超滤
将步骤(4)中得到的去沉淀的上清液采用分子量为5000Da的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5000 Da的截留液，冷冻干燥，得到罗氏海盘车蛋白酶解产物；
(6)生物活性肽的分离
将步骤(5)中得到的罗氏海盘车蛋白酶解产物用去离子水溶解为0.2g?0.5g/mL溶液，使用Sephadex LH-20凝胶色谱柱进行分离，流动相为蒸馈水，洗脱速度为0.8?1.0mL/min，220 nm测定吸光度，收集各吸收峰洗脱液，备用；
(7)抑菌活性测定、复合
将步骤(6)中得到的各吸收峰洗脱液进行抑菌活性测定;将测定具有抑菌活性的吸收峰洗脱液合并，冷冻干燥，得罗氏海盘车抗菌多肽。
[0007]所述的用水清洗是先用自来水清洗，再用去离子水清洗。
[0008]所述酶解罗氏海盘车的海产品水解酶为南宁东恒华道生物科技有限公司生产的海产品水解专用酶。
[0009]将酶解液离心是将酶解液送入离心机中，控制转速4000?5000 r/min，离心15?30 mino
[0010]所述酶解上清液的真空浓缩的条件为:真空度控制为82.7?90.6KPa，温度为45?55。。。
[0011]所述的各吸收峰洗脱液的抑菌活性测定是取10yL E.Co Ii菌液(OD6(K)nmS0.4?
0.5)涂布LB培养皿，设置3个重复;将步骤(5)中得到的各吸收峰洗脱液各取I_3yL涂布在涂有菌液的培养皿上，同时设置卡那霉素(Kan+，10 mg/mL)和ms1-78(100-150ng/ml)为阳性对照组;测定具有抑菌活性的吸收峰洗脱液。
[0012]本发明以罗氏海盘车为原料，切块匀浆后进行酶解，灭酶，离心，留取酶解上清液；将酶解上清液真空浓缩、乙醇沉淀多糖，得去沉淀的上清液;将去沉淀的上清液进行超滤，截留液采用凝胶过滤层析法进行生物活性肽的分离，收集各吸收峰洗脱液;将洗脱液进行抑菌检测，测得具有抑菌活性的吸收峰洗脱液合并后，冷冻干燥，得罗氏海盘车抗菌多肽。本发明采用凝胶色谱法从蛋白酶解产物中分离检测生物活性肽，使用了酶-膜耦联技术对罗氏海盘车进行了深层次开发;在进行活性多肽分离前，使用乙醇去除多糖，减轻后期多肽分离时的干扰。经后期检测，该复合多肽具有较好的体外抑菌活性。同时，作为天然的抑菌多肽，相比其他原核或真核表达产物，本发明所提取的抑菌多肽来源可靠，安全性高，后期研究方便。本发明提供的抗菌多肽的制备方法工艺先进、步骤合理、操作可行、产物安全性尚O
【附图说明】
[0013]下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
[0014]图1是各吸收峰洗脱液抑菌活性试验结果图。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
一种罗氏海盘车抗菌多肽的制备方法，其经过下列工艺步骤:
(1)原料预处理
选取新鲜的罗氏海盘车为原料，先用自来水清洗，再用去离子水清洗，去除泥沙，切成块状后送入匀浆机中，制得罗氏海盘车匀浆液；
(2)蛋白酶解产物的制备
将步骤(I)中得到的罗氏海盘车匀浆液加入与其等重量的超纯水，搅拌均匀，再加入3%(以底物蛋白含量计，w/w%)的南宁东恒华道生物科技有限公司生产的海产品水解酶，调整pH值至7.5，控制温度50°C，水解4h;水解后加热至95°C，保持1min灭酶，得酶解液;将酶解液送入离心机中，控制转速4500 r/min，离心20min，得酶解上清液；
(3)浓缩、干燥
将步骤(2)中得到的酶解上清液在真空度控制为85KPa，温度为50°C条件下，真空浓缩至固形物含量为20%，冷冻干燥，得固体粉末；
(4)去多糖
将步骤(3)中得到的固体粉末重新溶解于去离子水中，然后加入无水乙醇至乙醇终浓度为85%，静置过夜，离心，去除多糖沉淀，留取去沉淀的上清液；
(5)超滤
将步骤(4)中得到的去沉淀的上清液采用分子量为5000Da的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5000 Da的截留液，冷冻干燥，得到罗氏海盘车蛋白酶解产物；
(6)生物活性肽的分离
将步骤(5)中得到的罗氏海盘车蛋白酶解产物用去离子水溶解为0.3g/mL溶液，使用Sephadex LH-20凝胶色谱柱(2.0 cmX 60 cm)进行分离，流动相为蒸馈水，洗脱速度为
0.9mL/min，220 nm测定吸光度，收集得到5个吸收峰洗脱液，备用；
(7)抑菌活性测定、复合
将步骤(6)中得到的各吸收峰洗脱液进行抑菌活性测定;其中，抑菌活性测定是取100μL E.coli菌液(OD6QOnffi为0.4?0.5)涂布LB培养皿，设置3个重复;将步骤(5)中得到的5个吸收峰洗脱液各取2此涂布在涂有菌液的培养皿上，同时设置卡那霉素(Kan+，10 mg/mL)和ms1-78( 100-150ng/ml)为阳性对照组;如图1所示，测定吸收峰洗脱液2、吸收峰洗脱液5具有较好的抑菌活性，吸收峰洗脱液1、3、4无体外抑菌活性;将测定具有抑菌活性的吸收峰洗脱液2和吸收峰洗脱液5合并，冷冻干燥，得罗氏海盘车抗菌多肽。
[0016]本实施例提供的抗菌多肽的制备方法工艺先进、步骤合理、操作可行。制备的抑菌多肽来源可靠，安全性高，后期研究方便。
[0017]实施例2
一种罗氏海盘车抗菌多肽的制备方法，其经过下列工艺步骤:
(I)原料预处理
选取新鲜的罗氏海盘车为原料，先用自来水清洗，再用去离子水清洗，去除泥沙，切成块状后送入匀浆机中，制得罗氏海