一种同时检测mdr1和cyp19a1基因多态性的引物及其方法

文档序号:9762893阅读:421来源:国知局
一种同时检测mdr1和cyp19a1基因多态性的引物及其方法
【技术领域】
[00011本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种同时检测MDR1和CYP19A1基因多态 性的引物及其方法。
【背景技术】
[0002] 多药耐药基因(MDR1)编码P-糖蛋白(P-gp),它是人体药物转运中最重要的转运 体,能主动将疏水性抗肿瘤药物栗出胞外,从而减少细胞内药物浓度。几乎所有的肿瘤,包 括各种实体瘤、白血病、淋巴瘤等均有MDR1表达。
[0003] 现代研究发现,MDR1基因多态性直接影响p-gp的表达,与抗肿瘤药物与免疫抑制 剂等多种药物的代谢动力学有重要关联。 rs1045642(C3435T)、rsll28503(C1236T)和 rs2032582(G2677T/A)是蛋白编码区最常见的SNP位点,与药物代谢密切相关。MDR1基因 3435 CC/CT型使得MDR1表达增加,增大肿瘤细胞的耐药性,使蒽环类抗肿瘤药疗效不显著, 而TT型患者,能较好地吸收化疗药物,使药物在体内维持相对较高的血药浓度,对药物较为 敏感。
[0004] 芳香化酶是细胞色素 P450酶超家族成员,编码基因为CYP19A1,可催化睾酮、雄烯 二酮向雌酮、雌二醇转化,在雌激素生物合成中起最终的限速催化作用。芳香化酶抑制剂 (AIs)通过抑制芳香化酶,使雌激素水平下降,从而消除雌激素对肿瘤生长的刺激作用。绝 经后妇女的雌激素主要来源于雄激素前体物质在外周组织的芳香化,故该类药物主要用于 自然绝经或人工绝经后的乳腺癌患者。阿那曲唑、来曲唑(第三代非留体类AIs)对芳香化酶 的抑制程度可达99%以上。
[0005] 临床研究证实,CYP19A1基因多态性对芳香化酶抑制剂在乳腺癌的治疗效果有着 很大的影响作用。在接受来曲唑治疗的绝经后激素受体阳性转移性乳腺癌患者,携带 CYP19A1基因 rs4646G>T突变患者的的疾病进展时间比正常者明显延长。因此,CYP19A1 3'-UTR rs4646G>T是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂治疗疗效的有效预测指标。
[0006] 因此,检测MDR1和CYP19A1基因的多态性,可以有效的预测绝经期晚期乳腺癌患者 接受芳香化酶抑制剂的治疗疗效;同时还可以预测多种抗肿瘤药物与免疫抑制剂疗效及不 良反应风险,具有重要的临床价值。
[0007] 中国专利CN102816845B公开了一种MDR1的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂 盒,所述试剂盒包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,可用 于检测MDRUG2677T/A)位点是否发生突变。
[0008] 中国专利CN101781684B公开了 CYP19A1基因 SNP检测液相芯片及检测方法,所述液 相芯片包括有针对CYP19A1基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异性ASPE引物,每 种ASPE引物由5 '端的tag序列和3'端的针对目的基因 SNP位点的特异性引物序列组成。该检 测方法检测特异性好,可以实现多个SNP位点的并行检测。

【发明内容】

[0009]本发明的目的在于提供一种同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的引物及其方 法,该引物主要用于检测MDR1基因的MDR1_C3435T (SNP: rsl045642)位点和CYP19A1基因 c.*161T>G(SNP:rs4646)位点,具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点,为MDR1和 CYP19A1基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。
[0010]本发明提供了 一种同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的引物,包括PCR扩增引物 和SNaPshot PCR引物;所述PCR扩增引物包括:针对MDR1_C3435T的上游引物5'-GATGGCAAAGAAATAAAGCGACTG-3'(SEQ ID NO. 1)和下游弓丨物5'-ACTCGATGAAGGCATGTATGTTG-3 '(SEQ ID NO · 2),针对CYP19Al_rs4646的上游引物5'_ TCAAACTCTTGGCCTCTGCTTT-3'(SEQ ID N0.3)和下游引物5'- TGGCCCATGGCATTTTATAGG -3' (SEQ ID NO.4);所述SNaPshot PCR引物包括:针对MDR1_C3435T的SNaPshot PCR引物5'-TTTTTTTTTTTTTTTGTTGGCCTCCTTTGCTGCCCTCAC-3'(SEQ ID N0.5),针对CYP19Al_rs4646的 SNaPshot PCR引物5'- TTTTTTTTTTTTTTTTCTATGGGTTGTCACCAAGCTAGGTGCTATT-3'( SEQ ID N0.6)〇
[0011 ] 进一步地,所述PCR扩增引物中MDR1_C3435T和CYP19Al_rs4646的引物浓度比为1: 1,所述SNaPshot PCR引物中MDR1_C3435T和CYP19Al_rs4646的引物浓度比为1: 1。
[0012] 另外,本发明提供一种同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的方法,包括如下步 骤: S1提取DNA样品; S2以步骤S1提取的DNA样本为模板,采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR 扩增,并对扩增产物进行纯化; S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板,采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物 进行SNaPshot PCR扩增,并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化; S4采用毛细管电泳技术进行检测,对检测结果进行分析,确定SNP位点及其基因型。
[0013] 进一步地,所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
[0014] 进一步地,所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括:阶段1:98°C 3min;阶段2: 98°C 10s;阶段3:58°C 30s;阶段4:72°C lmin;阶段5:返回到阶段2,29个循环;阶段6:72°C 5min;阶段7:25°C保温。
[0015] 进一步地,所述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括:阶段1:96°C 10s;阶 段2:55°C 5s;阶段3:60°C 30s;阶段4:返回到阶段1,25个循环;阶段5:4°C保温。
[0016] 进一步地,所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
[0017] 除此之外,本发明提供的所述的同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的引物在制 备检测MDR1和CYP19A1基因多态性试剂中的用途。
[0018] 与现有技术相比,本发明提供的技术方案具有以下优势:本发明提供的同时检测 MDR1和CYP19A1基因多态性的引物具有特异性好,不会发生交叉反应,准确性高的优点,实 现了同时检测MDR1和CYP19A1基因多态性的检测,可以有效的预测绝经期晚期乳腺癌患者 接受芳香化酶抑制剂的治疗疗效;同时还可以预测多种抗肿瘤药物与免疫抑制剂疗效及不 良反应风险。
【附图说明】
[0019]图1为本发明提供的MDR1_C3435T基因引物的扩增片段; 图2为本发明提供的CYP19Al_rs4646基因引物的扩增片段; 图3为本发明提供的MDR1和CYP19A1基因 SNaPshot PCR引物的检测结果图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0021] 实施例一、引物 本发明提供的MDR1和CYP19A1基因引物如表1所示,包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR 引物,所述PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通 过UCSC数据库比对,无已知SNP位点。
[0022]表1本发明提供的引物
实施例二、引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting,结果如下: 1)MDR1和CYP19A1基因特异引物于UCSC中进行Blast,所有引物的扩增片段均覆盖了相 应的检测位点,无其它同源基因,MDR
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