一种检测mdr1基因多态性的引物及其方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测MDR1基因多态性的引物及其方 法。
【背景技术】
[0002] 多药耐药基因（MDR1)编码P-糖蛋白（P-gp)，它是人体药物转运中最重要的转运 体，能主动将疏水性抗肿瘤药物栗出胞外，从而减少细胞内药物浓度。几乎所有的肿瘤，包 括各种实体瘤、白血病、淋巴瘤等均有MDR1表达。
[0003] 现代研究发现，MDR1基因多态性直接影响p-gp的表达，与抗肿瘤药物与免疫抑制 剂等多种药物的代谢动力学有重要关联。 rs1045642(C3435T)、rsll28503(C1236T)和 rs2032582(G2677T/A)是蛋白编码区最常见的SNP位点，与药物代谢密切相关。MDR1基因 3435 CC/CT型使得MDR1表达增加，增大肿瘤细胞的耐药性，使蒽环类抗肿瘤药疗效不显著， 而TT型患者，能较好地吸收化疗药物，使药物在体内维持相对较高的血药浓度，对药物较为 敏感。MDR1基因12外显子C1236T多态性，与脑胶质瘤替莫唑胺疗效相关，1236CC基因型患者 的总生存期优于CT和TT基因型患者。MDR1基因 G2677T/A多态性，与紫杉醇的疗效相关， 2677GG基因型患者的总生存期差于GA、GT、TT、TA基因型患者。因此，检测MDR1基因多态性具 有重大的临床意义。
[0004] 中国专利CN102816845B公开了一种MDR1的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂 盒，所述试剂盒包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂，可用 于检测MDRUG2677T/A)位点是否发生突变。但是，上述检测方法存在检测项目单一，灵敏度 低的缺陷，不利于该检测试剂盒的推广和应用。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中检测MDR1基因多态性的方法存在的缺陷，本发明的目的在于 提供一种检测MDR1基因多态性的引物及其方法，该引物主要用于检测MDR1基因的MDR1_ C1236T (SNP: rsll28503)、MDRl_G2677T/A (SNP: rs2032582)、MDRl_C3435T (SNP: rsl045642)三个位点，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，为MDR1基因多态性提供 了一种简单有效的检测方法。
[0006] 本发明提供了一种检测MDR1基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPsho t P c R引物；所述P C R扩增引物包括：针对M D R 1 _ C 1 2 3 6 T的上游引物5 ' -TCAGTTCCTATATCCTGTGTCTGTGAA-3 '（ SEQ ID N0 · 1 )和下游弓丨物5'-GCTGGACTGTTGTGCTCTTCC-3 '（ SEQ ID NO · 2)，针对MDR1_G2677T/A的上游引物5 ' -CCCATCATTGCAATAGCAGGAGT-3, (SEQ ID N0.3)和下游弓丨物5'_ GCATGAAAAAGATTGCTTTGAGGA-3'（SEQ ID N0.4)，针对MDR1_C3435T的上游引物5'-GATGGCAAAGAAATAAAGCGACTG-3'（SEQ ID N0.5)和下游弓丨物5'_ ACTCGATGAAGGCATGTATGTTG-3'（SEQ ID N0.6);所述SNaPshot PCR引物包括：针对MDR1_ C1236I^9SNaPshotPCI^|*5'-CTCTGCACCTTCAGGTTCAG-3'（SEQIDN0.7)Ji^tMDRl_ G2677T/A的SNaPshot PCR引物5'- TTTTTTATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAG-3'（SEQ ID N0.8)， 针对MDR1_C3435T的SNaPshot PCR引物5'- TTTTTTTTTTTTTTTGTTGGCCTCCTTTGCTGCCCTCAC-3'（SEQ ID N0.9)。
[0007] 进一步地，所述 PCR 扩增引物中MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A 和 MDR1_C3435T 的引 物浓度比为1:1:1，所述SNaPshot PCR引物中MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A和MDR1_C3435T 的引物浓度比为1:1:1。
[0008] 另外，本发明提供一种检测MDR1基因多态性的方法，包括如下步骤： S1提取DNA样品； S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR 扩增，并对扩增产物进行纯化； S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物 进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化； S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
[0009] 进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
[0010]进一步地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括:阶段1:98°C 3min;阶段2: 98°C 10s;阶段3:58°C 30s;阶段4:72°C lmin;阶段5:返回到阶段2,29个循环;阶段6:72°C 5min;阶段7:25°C保温。
[0011] 进一步地，所述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括:阶段1:96°C 10s;阶 段2:55°C 5s;阶段3:60°C 30s;阶段4:返回到阶段1，25个循环;阶段5:4°C保温。
[0012] 进一步地，所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
[0013]除此之外，本发明提供的所述的检测MDR1基因多态性的引物在制备检1_R1基因 多态性试剂中的用途。
[0014]与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势:本发明提供的检测MDR1 基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了检测MDR1基 因多态性的检测，可以有效的预测绝经期晚期乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂的治疗疗 效;同时还可以预测多种抗肿瘤药物与免疫抑制剂疗效及不良反应风险。
【附图说明】
[0015]图1为本发明提供的MDR1_C1236T基因引物的扩增片段； 图2为本发明提供的MDR1_G2677T/A基因引物的扩增片段； 图3为本发明提供的MDR1_C3435T基因引物的扩增片段； 图4为本发明提供的MDR1基因 SNaPshot PCR引物的检测结果图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0017] 实施例一、引物 本发明提供的MDR1基因引物如表1所示，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，所述 PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数 据库比对，无已知SNP位点。
[0018]表1本发明提供的引物
实施例二、引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，结果如下： 1)MDR1和CYP19A1基因特异引物于UCSC中进行Blast，所有引物的扩增片段均覆盖了相 应的检测位点，无其它同源基因，MDR1_C1236T扩增片段位于chr7:87179522-87179674,长 度为153bp，扩增序列图如图1;MDR1_G2677T/A扩增片段位于chr7:87160475-87160699,长 度为225bp，扩增序列图如图2 ;MDR1_C3435T扩增片段位于chr7:87138602-87138791，长度 为190bp，扩增序列图如图3。
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