脊椎动物源性成分的通用pcr检测引物及检测方法

文档序号:9762904
脊椎动物源性成分的通用pcr检测引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子检测技术领域,具体涉及一种脊椎动物源性成分的通用PCR检测 引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 在现代文明社会的光环中,人类受利益驱使非法捕杀各类动物的行为屡禁不止, 严重破坏着生态平衡。在商品交易中假冒珍稀动物制品中药材和皮张的现象也有增无减, 严重损害了消费者的权益。从动物疫病防控的角度出发,我国也对动物类农副产品的养殖、 生产和加工过程出台了多部相关法律法规,如国家农业部出台的农牧发2001年第7号文件, 就针对疯牛病和羊痒病的防控规定了禁止在反刍动物饲料中添加和使用动物性饲料。对于 上述各种涉及动物、动物器官或组织、动物制品的生产行为、使用行为、交易行为以及非法 行为,都需要对其物种来源进行科学、准确的鉴定,这即是执法的重要依据,也是进行动物 保护、规范生产过程和维护消费者权益的核心手段。
[0003] 根据《中国动物分类代码第1部分脊椎动物》(GB/T 15628.1-2009)的分类,脊椎动 物门包括无颂纲、两栖纲、哺乳纲、鸟纲、鱼纲和爬行纲,这其中包含了我们日常生活中接触 到的几乎所有家畜、家禽、飞鸟、鱼类和野生动物。由于脊椎动物的生物成分复杂,相关动物 制品的化学成分繁多,且含有大量的蛋白质、脂肪等相似成分,运用一般的感观和理化鉴别 方法效果都不甚理想,现有红外光谱分析等相关技术由于自身的不足也无法十分准确或便 捷地鉴定。PCR技术以其较高特异性和灵敏度被国内外普遍采用,但现有检测方法大多局限 于一种或几种动物源性成分的方法,针对脊椎动物门的通用检测、鉴定技术的研究还较为 少见。

【发明内容】

[0004] 针对现有技术中所存在的不足,本发明的目的在于提供一种脊椎动物源性成分的 通用PCR检测引物及检测方法。
[0005] 本发明所采取的技术方案是:
[0006] -种用于检测脊椎动物源性成分的通用PCR引物对,其是根据脊椎动物门线粒体 DNA的共有序列设计的。
[0007] 作为优选的,所述引物对的核苷酸序列如下所示:
[0008] F-primer:5'-TGTTTACCAAAAACATCACCTCCA-3'(SEQ ID N0.1);
[0009] R-primer:5'-AGTTAAAGCTCCATAGGGTCT-3'(SEQ ID N0.2)。
[0010] -种脊椎动物源性成分的PCR检测方法,包括如下步骤:
[0011] (1)提取样品DNA作为扩增模板,脊椎动物源性样品DNA为阳性对照;
[0012] (2)以权利要求1或2所述的引物对进行PCR扩增;
[0013] (3)对PCR产品进行凝胶电泳,根据电泳结果判断样品中是否含有麝源性成分。
[0014] 25yL PCR反应体系的组成为:2XTaq PCR Master mix 12.5yL,10ymol/L上下游 引物各1. OyL,DNA模版2. OyL,补水至25yL。
[0015] PCR 反应程序为:94°C4min; 94°C30s,58°C30s,72°C30s,35 个循环;72°C5min。
[0016] 本发明的有益效果是:
[0017]本发明根据GenBank中公布的多种脊椎动物线粒体DNA(mtDNA)序列,在其高度保 守区域设计了一对通用型引物并建立通用PCR检测方法,实验结果表明该引物通用性强,实 现了对所有收集到的样品的有效扩增,结合测序结果实现了对物种的有效鉴定。
【附图说明】
[0018] 图1为脊椎动物源性成分PCR方法通用性试验结果(M:DNA Marker DL2000;N:阴性 对照;B:空白对照;1:牛肉;2:猪肉;3:羊肉;4:鸡肉;5:水貂皮;6:鹿角;7:驴肉;8:鹅肉;9: 麝皮张;10:狐狸皮张;11:鸭肉;12:狗肉;13:兔肉;14:羚羊角;15:犀牛角粉末;16:象牙; 17:老鼠肉;18:驼峰肉;19:熊胆;20:猫毛;21:马肉;22:魔鬼鱼;23:七彩雷龙鱼;24:鳗鱼; 25:金龙鱼;26:银龙鱼27:罗非鱼;28:秋刀鱼;29:三文鱼;30:鲫鱼;31:鲈鱼;32:草鱼;33: 凤尾鱼;34:金钱鱼;35 :小黄鱼;36:灰鲳;37:眼斑拟唇鱼;38:黄颡鱼;39:带鱼;40:怪蝴蝶 鱼;41:潜水艇鱼;42:虎头鲨;43:麦氏真鲨;44:犁鳍柠檬鲨;45:太平洋鼠鲨;46:海马干; 47:鸟羽毛;48:鸽子肉;49:蛙肉;50:乌龟);
[0019] 图2为脊椎动物源性成分PCR方法灵敏度试验结果(M:DNA Marker DL2000;N:阴性 对照;1-10:梯度依次为 1〇1()、?ο9、?ο8、?ο7、?ο 6、?ο5、?ο4、?ο3、?ο2、?ο 1)。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
[0021 ] 1材料和方法
[0022] 1.1样品
[0023]实验室保存和外购的脊椎动物组织样品共114份,其中哺乳纲63份,鱼纲33份,鸟 纲14份,两栖纲2份,爬行纲2份。
[0024]表1哺乳纲动物样品
[0026] 表2鱼纲动物样品 [0027]
[0028] 表3其它纲样品
[0030] 1.2主要试剂
[0031] DNA提取试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit为美国OMEGA公司产品,PCR反应体系 TIANGEN Taq PCR Mastermix为天根生化科技(北京)有限公司产品,DNA Marker DL 2000 为TaKaRa产品,购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0032] 1.3主要仪器
[0033] 9700 PCR仪为美国Applied Biosystems公司产品。Alpha Imager HP凝胶成像分 析系统为美国Alpha Innotech公司产品。Sigma 3-18K小型高速冰冻台式离心机为德国 Sartorius公司产品。NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer紫外分光光度计为美国 NanoDrop Technologies公司产品。
[0034] 1.4PCR引物的合成
[0035] 根据GenBank中公布脊椎动物线粒体DNA(mtDNA)序列,利用生物学软件Clustal X 比对后在高度保守区域用01ig〇7.0设计一对脊椎动物通用PCR引物,由上海辉睿生物科技 有限公司合成,引物序列见表4。
[0036]表4脊椎动物引物序列
[0037]
[0038] 1 · 5样品的DNA提取及PCR扩增
[0039] 按照DNA提取试剂盒说明书提取样品DNA。将样品DNA作为模板进行PCR扩增,并对 PCR产物进行凝胶电泳。PCR反应体系为25yL:2XTaq PCR Master mix 12.5yL,10ymol/L上 下游引物各 1 · 〇yL,DNA 模版 2 · OyL,补水至 25yL。反应程序:94°C4min; 94°C30s,58°C30s,72 °C30s,35 个循环;72°C5min。
[0040] 1.6PCR产物的电泳及测序
[00411扩增结束后于1 %琼脂糖凝胶和IX TBE缓冲溶液中电泳检测,电压100V,30min。电 泳结束后,用Alpha Imager HP凝胶成像分析系统观察电泳后的结果,并将有目的条带的 PCR产物进行克隆测序,获得序列后使用美国国家生物技术中心(NCBI)的GenBank数据库的 搜索工具Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)[11]来确定物种来源。
[0042] 1.7PCR方法通用性试验
[0043] 以114份脊椎动物组织样品提取的DNA为模板,使用上述反应体系和条件进行PCR 扩增,验证所建立的PCR方法的通用性。
[0044] 1.8PCR方法灵敏度试验
[0045] 将PCR产物电泳检测,有目的条带的PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公 司武汉分公司、广州分公司进行测序鉴定,并以牛的重组质粒作为阳性标准品。将重组质粒 用紫外分光光度计测定质粒浓度,根据阿伏伽德罗常数换算为目的基因的拷贝数,以10倍 梯度稀释至10拷贝ΛΛ,对梯度稀释的阳性对照进行PCR检测。
[0046] 2动物源性样品检测结果与分析
[0047] 2.1脊椎动物源性成分样品的PCR扩增及种属鉴定结果
[0048] 114份脊椎动物源性成分样品DNA全部成功扩增,产物大小约为249bp,此结果与预 期相符。将所有PCR产物克隆测序,得到序列在GenBank中比对,比对结果与已知来源的动物 样品结果一致。
[0049] 其中50份样品凝胶电泳结果见图1,在GenBank中比对结果从1-50依次为黄牛、野 猪、山羊、原鸡、水貂、驯鹿、驴、鸿雁、马麝、赤狐、绿头鸭、家犬、家兔、赛加羚羊、白犀、亚洲 象或非洲象、褐家鼠、双峰驼、亚洲黑熊、沙丘猫、野马、珍珠魟、七彩雷龙鱼、日本鳗、金龙 鱼、银龙鱼、罗非鱼、秋刀鱼、大西洋鲑鱼、鲫鱼、自卢鱼、草鱼、凤尾鱼、金钱鱼、小黄鱼、灰鱼昌、 眼斑拟唇鱼、黄颡鱼、带鱼、怪蝴蝶鱼、暗绿飩、虎头鲨、麦氏真鲨、犁鳍柠檬鲨、太平洋鼠鲨、 吻海马、鹌鹑、原鸽、虎纹蛙、豹纹陆龟。
[0050]其中93份样品使用国家标准和行业标准进行检测,结果与通用PCR产物测序结果 一致,见表5。
[0051 ] 表5标准验证结果
[0055] 将质粒进行梯度稀释,稀释好的质粒进行PCR扩增后进行电泳分析,发现其最低检 测浓度可以达到1 〇2拷贝数量级,见图2。
[0056] 脊椎动物物种繁多,在食品、药品、保健品、纺织行业、手工艺行业、动物观赏等方 面都与人类的日常生活密切相关,足以影响人类的日常起居。同时,脊椎动物又在自然界中 扮演着极其重要的角色,覆盖了生物链的极大部分。鉴于其代表性、重要性、普遍性和广泛 性,在任何时期研究脊椎动物物种鉴定的方法都具有十分显著的意义。
[0057]本发明根据GenBank中公布的多种脊椎动物线粒体DNA(mtDNA)序列,在其高度保 守区域设计了一对通用型引物并建立通用PCR检测方法,实验结果表明该引物通用性强,实 现了对所有收集到样品的有效扩增,结合测序结果实现了对物种的有效鉴定。
【主权项】
1. 一种用于检测脊椎动物源性成分的通用PCR引物对,其特征在于,所述引物对是根据 脊椎动物门线粒体DNA的共有序列设计的。2. 根据权利要求1所述的用于检测脊椎动物源性成分的通用PCR引物对,其特征在于, 所述引物对的核苷酸序列如下所示: F-primer:5 '-TGTTTACCAAAAACATCACCTCCA-3 '; R-primer:5 '-AGTTAAAGCTCCATAGGGTCT-3 ' 〇3. -种脊椎动物源性成分的PCR检测方法,包括如下步骤: (1) 提取样品DNA作为扩增模板,脊椎动物源性样品DNA为阳性对照; (2) 以权利要求1或2所述的引物对进行PCR扩增; (3) 对PCR产品进行凝胶电泳,根据电泳结果判断样品中是否含有麝源性成分。4. 根据权利要求3所述的动物源性成分的PCR检测方法,其特征在于,25yL PCR反应体 系的组成为:2XTaq PCR Master mix 12.5yL,10ymol/L上下游引物各 1.0yL,DNA模版2·0μ L,补水至25yL。5. 根据权利要求3所述的动物源性成分的PCR检测方法,其特征在于,PCR反应程序为: 94°C4min; 94°C30s,58°C30s,72°C30s,35 个循环;72°C5min。
【专利摘要】本发明公开了一种脊椎动物源性成分的通用PCR检测引物及检测方法。所述引物的序列为:F-primer:5’-TGTTTACCAAAAACATCACCTCCA-3’;R-primer:5’-AGTTAAAGCTCCATAGGGTCT-3’。本发明根据GenBank中公布的多种脊椎动物线粒体DNA(mtDNA)序列,在其高度保守区域设计了一对通用型引物并建立通用PCR检测方法,实验结果表明该引物通用性强,实现了对所有收集到样品的有效扩增,结合测序结果实现了对物种的有效鉴定。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105525014
【申请号】CN201610061006
【发明人】薄清如, 罗宝正, 赵福振, 邵建宏, 陈轩, 姚丽锋, 彭玉芬, 陈敬
【申请人】珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月28日
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