一种检测马铃薯帚顶病毒的巢式rt-pcr方法及其引物组合的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于作物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测马铃薯帚顶病毒的巢式 RT-PCR方法及其引物组合。
【背景技术】
[0002] 马铃薯又称土豆、洋芋等，是人们日常生活中常见的粮食及蔬菜作物，作为粮食作 物来说，是世界上仅次于小麦、玉米和水稻的第四大粮食作物。就我国来说，马铃薯的栽培 面积及总产量均居世界前列，但其单产与品质却远远不及其他生产马铃薯的先进国家。马 铃薯病毒病的危害是产生这种现状主要原因之一。我国马铃薯病毒病危害严重，不仅由于 一次侵染造成影响，而且能够通过种薯进行传播，造成再次侵染，危害程度逐代严重，从而 造成马铃薯种薯退化，影响马铃薯的产量及品质，马铃薯病毒病成为了我国马铃薯产业实 现又快又好的发展的主要限制因素 [1]。
[0003] 马铃薯帚顶病毒（potato mop-top virus，PMTV)为马铃薯病毒属（Pomovirus)典 型成员之一 m]，在气候比较冷凉地区分布较为广泛，造成马铃薯产量损失惨重[4]，PMTV由 粉痂菌进行传播，而粉痂菌适宜在阴凉和沙质土壤的条件下生长，这是PMTV多发生在冷凉 地区的主要原因 [5<] WMTV诱导的马铃薯块茎上的症状通常为表皮轻微隆起，产生环状坏死 或弧状坏死，在不同马铃薯品种上的症状表现相差很大，并且还受温度等环境因素的影响， PMTV诱导的马铃薯块茎坏死症状与烟草脆裂病毒(TRV)、马铃薯Y病毒块茎坏死株系PVYNTN 诱导的块茎坏死症状相似。
[0004] 目前，常见的PMTV检测方法有ELISA和RT-PCR，RT-PCR检测灵敏度高于ELISA[7-11 ]。受生长环境影响，感染PMTV的植株体内病毒含量较低，感染PMTV的马铃薯经过块茎繁 殖后，病毒含量大大降低，给病毒检测带来很大的挑战，为提高检测效率，常在检测前将感 染块茎放在较高的温度或波动的温度下贮藏数周，然后进行检测[12]，此方法耗时较长，且 其检测可靠性有待考证。准确检测PMTV-直是一个难题[7]，由于病毒含量太低，超过了 ELISA、一次RT-PCR检测灵敏度，常常导致检测结果呈假阴性。因此，为提高PMTV检测的准确 性，提高检测效率，降低检测成本，本发明根据Genbank发布的这些病毒全基因组或部分序 列的保守序列，设计通用引物，旨在建立一个高灵敏度、高效、低成本的巢式RT-PCR检测技 术，为研究国内外马铃薯帚顶病毒病流行情况及脱毒马铃薯种薯的病毒检测提供技术支 撑。
[0005] 参考文献
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【发明内容】
[0006]本发明针对国内外发现的马铃薯帚顶病毒(PMTV)，根据Genbank发布的该病毒全 基因组或部分序列的保守序列，设计两对通用引物，发明一种巢式RT-PCR的检测方法，高效 准确地检测该病毒。
[0007] 因而，本发明所要解决的技术问题是:针对马铃薯帚顶病毒在寄主体内复制的水 平较低，RT-PCR检测灵敏度有限，建立一种灵敏度和特异性更高的巢式RT-PCR马铃薯帚顶 病毒检测方法，准确高效地检测该病毒。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种巢式RT-PCR高效检测 马铃薯帚顶病毒(PMTV)的方法，针对马铃薯帚顶病毒的基因组保守序列设计2对通用引物， 并建立巢式RT-PCR的反应体系和程序，高效准确地检测马铃薯帚顶病毒(PMTV)。
[0009] 根据Genbank发布的该病毒全基因组或部分序列的保守序列，并根据巢式RT-PCR 的要求，设计了两对通用引物(表1)，第一对引物的扩增片段大小为460bp，在该扩增片段内 再设计一对引物，即为第二对引物，称为巢式引物，产物扩增片段大小为263bp。
[0010] 表1 PMTV巢式RT-PCR检测引物
本发明检测方法具体包括以下步骤： 1) 马铃薯块茎或植株RNA的获得:取带病的马铃薯块茎或植株适量，用液氮研磨，采取 Trizol方法提取RNA; 2) 以步骤1)得到的RNA为模板，以6碱基随机引物Random Primers为反向引物，通过反 转录，得到cDNA; 3) 以步骤2)得到的cDNA为模板，用表1中的第一对引物对其进行PCR扩增； 4) 以步骤3)得到的PCR产物为模版，用表1中的第二对引物对其进行PCR扩增； 本发明中巢式PCR的条件为： 第一次PCR反应体系（25 μL): PCR mix 12.5 μL、模板(cDNA)4 μL、表1中每对正向引 物和反向引物各1 μL、超纯水补至所需体积； 第一次PCR程序：92°C 2min预变性后，39个循环参数为，92°C 30s，58°C 30s，72°C lmin，最后 72°C 10min〇<