三磷酸腺苷近红外荧光探针的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及小分子荧光探针技术领域，特别涉及三磷酸腺苷近红外荧光探针的制 备方法。
【背景技术】
[0002] 三磷酸腺苷（简称ATP)是一类高能磷酸化合物。在细胞中它与二磷酸腺苷（简称 ADP)的相互转化实现储能和放能，从而保证细胞各项生命活动的能量供应;对ATP的检测有 利于我们了解生命体新陈代谢过程，为与ATP相关的疾病诊断提供帮助。开发新型的ATP分 子荧光探针具有非常重要的现实意义和应用前景。
[0003] 荧光探针具有高度灵敏性，优良的选择性，反应时间短以及易于操作等优点；在 ATP的检测中，荧光探针是一种有效的检测方法。方酸菁染料(SQ)作为一种近红外吸收的染 料，具有优越的光学性能，即它能降低生物体内物质的自吸收和自发荧光的干扰，提高检测 的灵敏度和选择性，降低对生命体的损伤，肉眼即可观察颜色的变化，所以近红外染料在生 活中发挥着重要的作用。
[0004] 三磷酸腺苷广泛存在于动植物的细胞中，其直接为生命活动提供能量。目前检测 ATP的探针多为有机荧光染料，如:喹琳类、荧光素、罗丹明、芳烃类及其衍生物等，但是这些 荧光染料存在着一些不足，如：对样品激发光的散射光敏感，这会使探针的检测灵敏度下 降。此外，在一定范围内，荧光分子在被测分子上标记的数目越多，其荧光强度会下降，这对 ATP检测是不利的。尽管有很多探针可被用于ATP的检测，但是一部分探针的灵敏度不高，或 者不能够区分与ATP性质相似的分子。而近红外荧光染料是采用近红外光谱分析的，其本身 具有很强的穿透能力，在检测样品时，不需要对样品进行繁琐的处理，使用方便快捷，并可 以降低生物体内物质的自吸收和自发荧光的干扰，所以近红外荧光探针具有很好的应用前 景。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供三磷酸腺苷近红外荧光探 针的制备方法，能够对ATP快速、灵敏地分析，并克服现有荧光探针的缺点，高效检测ATP，具 有合成步骤简单，荧光法分析快捷方便，干扰较小的特点。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0007] 三磷酸腺苷近红外荧光探针的制备方法，其步骤为：
[0008] S1、将方酸菁染料溶于有机溶液中，获得方酸菁有机溶液；
[0009] S2、将N，N-二（2-氨乙基)-1，2-乙二胺溶于有机溶液中，获得N，N-二（2-氨乙基)-1，2-乙二胺有机溶液；
[0010] S3、将方酸菁有机溶液滴加到N，N-二(2-氨乙基)-1，2_乙二胺有机溶液中，在室温 环境下搅拌2小时，然后去除有机溶液，经柱色谱分离提纯，获得三磷酸腺苷近红外荧光探 针。
[0011] 所述有机溶液包括二氯甲烷溶液，特别包括无水二氯甲烷。
[0012] 所述方酸菁有机溶液的浓度为4.19mM〇
[0013] 所述N，N-二（2-氨乙基）-l，2-乙二胺有机溶液的浓度为24.07mM。
[0014] 所述方酸菁染料与N，N-二(2-氨乙基)-l，2-乙二胺的摩尔比为1:6。
[0015] 所述室温环境为18-25°C。
[0016]所述三磷酸腺苷近红外荧光探针的分子结构式为：
[0018]本发明的工作原理为：
[0019]将方酸菁染料与N，N_二(2-氨乙基)-1，2_乙二胺在有机溶剂一一二氯甲烷溶液中 进行反应，反应生成三磷酸腺苷近红外荧光探针。
[0020] 本发明的有益效果为：
[0021] 本发明可以克服现有荧光探针性能上的不足，能够高效、灵敏的在缓冲体系中检 测ATP;探针在与ATP作用后，会不断使探针的荧光增强，并可极大地减少外界的干扰，达到 理想的效果，这是该近红外荧光探针优势所在。本发明具有合成步骤简单，荧光法分析快捷 方便，干扰较小等优点。
【附图说明】
[0022] 图1是本发明制备的近红外荧光探针的缓冲溶液中逐渐加入ATP后的紫外吸收谱 图。
[0023]图2是本发明制备的近红外荧光探针的缓冲溶液中逐渐加入ATP后的荧光谱图。
[0024] 图3是本发明制备的近红外荧光探针的荧光强度与ATP之间的线性关系图。
[0025] 图4是本发明制备的近红外荧光探针的检测专一性的实验图。
[0026] 图5是本发明制备的近红外荧光探针对不同的核苷磷酸的响应图。图中，为ATP， ?为ADP，▲为AMP，▼为CTP，婣为GTP，?为TTP，?为UTP。
[0027] 图6是本发明制备的近红外荧光探针与不同的核苷磷酸作用后所呈现的颜色变化 图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0029]参见附图，本发明为三磷酸腺苷近红外荧光探针的制备方法，其步骤为：
[0030] S1、将方酸菁染料溶于有机溶液中，获得方酸菁有机溶液；
[0031 ] S2、将N，N-二（2-氨乙基)-1，2-乙二胺溶于有机溶液中，获得N，N-二（2-氨乙基)- 1，2-乙二胺有机溶液；
[0032] S3、将方酸菁有机溶液滴加到N，N-二(2-氨乙基)-l，2-乙二胺有机溶液中，在室温 环境下搅拌2小时，然后去除有机溶液，经柱色谱分离提纯，获得三磷酸腺苷近红外荧光探 针。
[0033]所述有机溶液包括二氯甲烷溶液，特别包括无水二氯甲烷。
[0034]所述方酸菁有机溶液的浓度为4.19mM。
[0035] 所述N，N-二(2-氨乙基)-1，2-乙二胺有机溶液的浓度为24 · 07mM。
[0036]所述方酸菁染料与N，N-二(2-氨乙基)-1，2_乙二胺的摩尔比为1:6。
[0037] 所述室温环境为18_25。(3。
[0038]所述三磷酸腺苷近红外荧光探针的分子结构式为：
[0042]公式 1
[0043]实施例一:三磷酸腺苷近红外荧光探针。
[0044]本实施例包括以下步骤：
[0045] S1、将250mg的方酸菁染料溶于IOOmL的无水二氯甲烷中，获得方酸菁有机溶液；
[0046] S2、将360yL的N，N-二（2-氨乙基)-1，2_乙二胺溶于无水二氯甲烷中，获得N，N-二 (2-氨乙基)_1，2-乙二胺有机溶液；
[0047] S3、将方酸菁有机溶液滴加到N，N_二(2-氨乙基)_1，2_乙二胺有机溶液中，在室温 环境下剧烈搅拌2小时，然后去除无水二氯甲烷，获得近红外染料粗品，然后经柱色谱分离 提纯，获得蓝紫色固体粉末状的三磷酸腺苷近红外荧光探针。
[0048]获得的三磷酸腺苷近红外荧光探针的分子结构如下所示：
[0050] ATP分子荧光探针结构表征数据如下：
[0051] 1H NMR(DMS0-d6,500MHz)，S(ppm)8.68(s，2H)，7.78(s，2H)，7.72(d，2H，J = 7.5)， 7.46(d,2H ,J = 8.0) ,7.42(dd,4H ,Ji = 7.5 ,J2 = 14.0) ,7.26(t, 2H ,J = 7.5), 7.208(t, 2H J = 9.0),6.88(t,2H,7.5),6.10(s,2H),5.80(s,2H) ,4.26(dd ,4H ,Ji = 7.0 J2 = 14.0), 3.75 (s,4H) ,3.00(t,2H,J = 6.0) ,2.92(t,4H,J = 5.0) ,2.85(t,2H,J = 6.5) ,1.23-1.17(m, 18H).13C NMR(DMS0-d6,125MHz) ,5(ppm)173.36,163.09,160.94,159.62,157.58,156.02, 140.07,128.20,127.91,122.24,I19.66,I13.06,112.56,86.42,85.99,12.83.MS(ESI+) found 1125.66.[M-CF3SO3J+,calcd for 1125.29.
[0052] ATP分子荧光探针性能实验
[0053] 将已合成好的ATP分子荧光探针配成含有1%的二甲基亚砜(DMSO)缓冲溶液，然后 将缓冲溶液稀释到检测所需要的浓度，对探针的性能进行检测。
[0054] (I)ATP分子荧光探针的缓冲溶液中不断加入ATP，对该探针的紫外吸收进行分析。
[0055] 参见图1，图1所示的为本发明制备的近红外荧光探针的缓冲溶液中逐渐加入ATP 后的紫外吸收谱图；图中，横坐标为波长（wavelength)，单位为nm;纵坐标为吸光度 (absorption)〇
[0056] 将ATP不断地加入到溶有近红外荧光探针的缓冲液中，探针的浓度为5微摩尔每 升，如图所示，随着ATP的不断加入，590nm处的聚集体的吸收峰开始逐渐减弱，在710nm处的 聚集体的吸收分开始逐渐的增强，实验结果表明，当ATP分子与近红外荧光