23-羟基白桦酸荧光探针、制备及其在细胞定位与摄取中的用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及一类新型的抗肿瘤活性天然产物 23-羟基白桦酸荧光探针的制备，特别涉及这类荧光探针用于检测23-羟基白桦酸在靶细胞 定位与摄取中的应用。
【背景技术】
[0002] 随着经济的发展，肿瘤已经成为威胁人类健康的头号杀手。几个世纪以来科学家 们一直致力于肿瘤的研究，针对各类肿瘤疾病的药物也随之被研发出来。临床数据表明 80%的抗肿瘤药物都来源于天然产物。天然产物对抗肿瘤药物的发展起到了重要的作用。 尽管天然产物在肿瘤治疗中取得了成功，但是大部分天然产物的抗肿瘤机制仍不明确，这 限制了天然产物的进一步发展，也对多药耐药带来了挑战。因此，对天然产物抗肿瘤机制的 研究迫在眉睫。
[0003] 五环三萜是自然界里含量最丰富的萜类之一，由于其生物活性多样，一直备受科 学家们的关注。其中23-羟基白桦酸(23-HBA)作为羽扇烷型天然产物，是从中药白头翁中分 离得到的白桦酸类似物，也是中药白头翁的主要活性成分之一，在抗肿瘤，抗HIV等方面有 着良好的应用前景。其对黑色素瘤细胞、神经外胚层肿瘤细胞、口腔上皮癌细胞、恶性脑瘤 细胞、白血病细胞等都具有较好的抑制或杀伤作用。除此之外，23-HBA对抗肿瘤药物还有协 同增敏活性，在较低浓度下即能显著提高肿瘤细胞对多种化疗药物的敏感度，增加抗肿瘤 药物在细胞内的蓄积。由于其活性好，毒性低，相信随着对白桦酸类化合物研究的不断深 入，此类化合物有可能开发成为抗肿瘤药物应用于临床。
[0004] 然而，23-HBA的抗肿瘤分子机制尚未完全阐明，细胞内的作用靶点与作用模式也 不明确，相关分子作用机制有待探索。故通过一定的技术手段，探明23-HBA在靶细胞作用中 的亚细胞定位及摄取，将有助于阐明其作用靶点和作用机制。
[0005] 当今创新药物的发现越来越依赖于靶点的发现及靶点与活性化合物作用模式的 确定，荧光标记技术在细胞水平由于具有高灵敏度和可定量分析的特点，已成为阐明药用 机制的重要手段，是研究天然产物作用模式、结合位点等生物学相关性质的有力工具。近年 来，荧光标记技术已广泛用于亚细胞定位、靶点与活性化合物作用方式等相关领域的研究。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种23-HBA荧光探针和其在细胞内定位及摄取中的应用。 本发明公开了一种23-HBA荧光探针，其含有荧光发色基团和23-HBA骨架结构，如通式(I)所 示：
[0008]其中 R 表示-NH(CH2)n-, η= 1-5;
[0009 ] -NH(CH2)nNHC(O) (CH2)2-^n= 1-5；
[0010] -O(CH2CH2O)nC(O) (CH2)2-^n= 1-5 ；
[0011] -NH( CH2) 0-; -0 (CH2) NH-; -NH (CH2CH2O) 2CH2- 〇
[0012] 本发明中所述的23-HBA荧光探针，最优选是R为-NH(CH2)nNHC(O) (CH2)2-，n = 2。
[0013] 所述荧光探针含有23-HBA骨架，保留了23-HBA的抗肿瘤活性，能够发挥癌症治疗 作用。进一步的肿瘤细胞实验证明，所述探针能够抑制肿瘤细胞的生长，具有潜在的抗肿瘤 功效。
[0014] 上述的23-HBA荧光探针的制备方法概述如下：
[0015] (1)在室温下，将香豆素荧光化合物与N-羟基琥珀酰亚胺在EDCI的作用下反应得 香豆素活性酯b; (2)将得到的活性酯b与N-Boc-乙二胺混合，加入缩合剂反应得到相应的N-Boc胺产物c; (3)将得到的N-Boc胺产物c与三氟醋酸混合脱除保护基得相应的胺化合物d; (4)将得到的胺化合物d与酸酐在DMAP作用下得到酸衍生物e; (5)将步骤(4)中得到的酸衍 生物e与23-羟基-28苄基白桦酸在草酰氯存在下反应得到23-羟基-28苄基白桦酸荧光探针 衍生物f; (6)将得到的荧光探针衍生物在H2，Pd/C的作用下脱去苄基得到23-HBA荧光探针 衍生物g。
[0016] 其合成路线如下：
[0018] 作为本发明制备方法的一个优选方案步骤(2)使用的是香豆素酸活性酯而非直接 用香豆素酸，反应时间大大缩短，基本没有副产物，极大提高目标化合物的收率。
[0019] 本发明的另一个优选方案，步骤(5)先用草酰氯将化合物e变成酰氯，再与23-羟 基-28-苄基白桦酸反应。因为23位的羟基虽然是伯羟基，但由于位阻，反应活性不是很高， 此方法提高了目标化合物的产率，而且极大缩短了反应时间。
[0020] 本发明的另一个优选方案，步骤(6)中的反应条件是50°C反应，且加入0.5mL的甲 醇，此方法加快了反应的进程，缩短了反应时间，优于传统溶剂只用四氢呋喃，且在室温下 反应的方法。
[0021] 本发明还提供了所述23-HBA荧光探针用于23-HBA抗肿瘤机制研究的用途，包括细 胞摄取和亚细胞定位的检测，内容如下：
[0022] -. 23-HBA荧光探针定性和定量的细胞摄取研究
[0023] a.通过荧光分光光度计，将一系列入射光（200-467nm)扫描ΙΟμΜ的23-HBA荧光探 针，确定最大激发波长为415nm，最大发射波长为475nm〇
[0024] b.将肿瘤细胞用浓度为2以1、4以1、1(^1、2(^1的23-冊4荧光探针分别处理1511^11、 30min、lh、2h、4h和24h，得到荧光探针处理的细胞。在415nm激发光下，用荧光显微镜观察细 胞摄取情况。
[0025] c.将肿瘤细胞用浓度为ΙΟμΜ的23-HBA荧光探针处理5min、15min、30min、60min、 120min和240min，得到荧光探针处理的靶细胞，用流式细胞仪，定量研究细胞摄取情况。 [0026] 二.23-HBA荧光探针共定位研究
[0027] a.根据细胞摄取的结果，将目标细胞用浓度为4μΜ的23-HBA荧光探针处理1小时， 得到荧光探针处理的细胞；
[0028] b .将步骤a中得到的细胞加入细胞器专属染料探针，得到细胞器探针标记的靶细 胞；
[0029] c.将步骤b中所得到的细胞在激光共聚焦显微镜下观察23-HBA荧光探针与靶细胞 器探针的荧光分布情况，根据荧光的重叠情况确定23-HBA在靶细胞中的定位。
[0030] 本发明中的方法可以用于检测哺乳动物的任何细胞，优选的细胞为肿瘤细胞。
[0031] 本发明中的细胞器探针可以根据检测的细胞器的不同，选择细胞生物学上可以接 受的任何探针，所优选的细胞器探针为细胞膜荧光探针、线粒体荧光探针或者是细胞核荧 光探针。更为优选的是线粒体红色荧光探针(MitoTracker?Deep Red FM)。
[0032]试验结果证实，该发明所述的23-HBA荧光探针能快速地进入到细胞中，并高选择 性地标记线粒体，表明线粒体是23-HBA的主要聚集位点。
[0033] 本发明具有以下有益效果:提供了一种具有香豆素荧光发色基团与23-HBA结构骨 架的荧光探针，该探针具有较好的抗肿瘤作用，兼有治疗与作用靶点研究的用途;本发明提 供了这类荧光探针的制备方法，条件温和，工艺简单;本发明运用荧光显微镜和流式细胞仪 提供了在不同浓度和不同时间点靶细胞对23-HBA荧光探针摄取情况;本发明同时也公开了 运用激光共聚焦显微镜来检测不同靶细胞中23-HBA荧光探针细胞分布的情况，为进一步研 究23-HBA细胞内作用靶点和作用机制奠定了基础。
【附图说明】：
[0034] 图1:23-HBA荧光标记探针g对多种细胞株的杀伤作用。
[0035]图2:23-HBA荧光标记探针g与B16F10细胞孵育后不同时间点细胞内的染色情况： [0036] A图为荧光显微镜定性检测:a图化合物浓度为2yM;b图为浓度4yM;c图为浓度10μ M;d图为浓度20μΜ;ΒΧ图为流式定量检测:化合物g的浓度为ΙΟμΜ，检测时间为5min，15min， 30min，60min，120min，240min〇
[0037] 图3:23-HBA荧光探针与线粒体专属荧光染料探针在B16F10细胞内的共定位染色 图：
[0038] a图为放大60倍的图像:左图表示23-HBA荧光探针的染色图，中间图为两部分的叠 加图，右图为线粒体专属荧光染料探针的染色图。
[0039] b图为放大40倍的图像:左图表示23-HBA荧光探针的染色图，中间图为两部分的叠 加图，右图为线粒体专属荧光染料探针的染色图。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1
[00411 23-HBA荧光探针的合成
[0042] 将化合物a(2g，7.7mmol)与N-羟基琥泊酰亚胺（1.3g，11.5mmol)及EDCI (1.8g， 9.2mmoI)溶于二氯甲烷中（20.0 mL)，室温搅拌4h，浓缩后加入水，二氯甲烷提取(30mL X 3)， 合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水似25〇4干燥，浓缩后柱层析(012(：1 2/0130!1100:1，以 ￥)得到目标化合物"28,72.9%)。 1!1-匪1?(〇)(：13,30冊!^)5:??1111.26(6!1，^ = 7.1!^)， 2.90(4H，s)，3.48(4H，q，J = 7.1Hz)，6.45(lH，d，J=1.9Hz，Ar-H)，6.65(lH，dd，J = 9.0Hz，J = 2.2Hz，Ar-H)，7.38(lH，d，J = 9.0Hz，Ar-H)，8.59(lH，s，Ar-H)〇
[0043] 将化合物b(700mg，1.95mmol)与N-Boc-乙二胺（0.4mL)及DIPEA( 1.4mL)溶于二氯 甲烷中（20.0 mL)，室温搅拌3h，浓缩后加入水，二氯甲烷提取(30mL X 3)，合并有机层，水洗， 饱和食盐水洗，无水Na2SCk干燥，浓缩后柱层析(CH2CWCH 3OH 80:1，v/v)得到目标化合物c (700mg,88.8%)〇
[0044] 将化合物c(700mg)溶于二氯甲烷中（15. OmL)，并向溶液中加入三氟醋酸(3. OmL)， 室温搅拌2h，浓缩后加入10%的氢氧化钠溶液，二氯甲烷提取（