基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法_3

文档序号:9779466阅读:来源:国知局
M的四环素100微升,浓度为50mM的卡那霉素100 微升,混匀过后,倒入无菌培养板中,冷却后备用。印在培养基1和2上的细菌在37°C下培养 48小时,能够在培养基1上生存同时不能在培养基2上生存的单克隆即为含有CouKRS的菌 株。该菌株特异识别7-羟基香豆素赖氨酸。CouKRS的突变位点为L270I,Y349D,N311A, N313G,L270I,Y349D,N311A,N313G4 个突变位点不重叠。
[0050]在本实施例中,7-羟基香豆素是目的底物,因此在筛选的时候添加到筛选平板上。 配制母液是生化研究的常规或者常识。假设100毫升液体中含有若干成分,把他们直接混 合,体积会增大,只有配成母液,才能保证浓度的情况下,不影响体积。参考PCR中的10倍 buffer,就是母液。转化成功的菌株能够在氯霉素抗性平板上活下来。pylT-pREP质粒的作 用就是让识别氨基酸的酶活下来。PylT基因编码tRNA为香豆素氨酰-tRNA合成酶;通过 CouKRS的突变位点为1^2701,¥3490,似1认,吧136的设计及筛选最终可以得到只识别香豆素 赖氨酸,提高了特异性。从平板上获得抗性的目的菌株之后,进行表达蛋白质,Myoglobin (肌红蛋白)用来验证你筛选的CouKRS有用的目的蛋白。
[0051]如图6所示,图6为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S4的流程 示意图。在步骤S4中主要涉及在鲸鱼肌红蛋白Myoglobin-4TAG中插入7-羟基香豆素赖氨 酸,验证筛选得到的CouKRS可以实现在目的蛋白质制定位点实现插入。步骤S4共分为3个步 骤,分别是S41、S42和S43。为了实现上述目的,在步骤S41中,首先共转化CouKRS-pBK和 Myoglobin-4tag-pBAD至TOPlO中。挑取单克隆,接种到50毫升的LB培养基中,过夜培养扩 增。按照1:50的比例,把上述过夜培养扩增的细菌接种到200毫升的LB培养基中,并在培养 基中加入浓度为50mM的四环素 100微升,浓度为50mM的卡那霉素 200微升,在37°C下培养,待 A600达到0.5-0.6之间时,在培养基中加入1毫升浓度为IOOmM的7-羟基香豆素母液,于37°C 下继续培养10小时。上述大量培养的细菌,经4000rpm,15min离心,收集得到细菌。在步骤 S42中,收集步骤S41得到的细菌菌体进行高压破碎,离心速度为16000g,离心时间为20min, 得到细菌上清液。细菌上清液经过镍柱和分子筛纯化,得到纯化的Myoglobin蛋白质。经过 试验表明,插入了7-羟基香豆素的Myoglobin在488nm激光激发下能够发出绿色焚光,表明 7-羟基香豆素介导的蛋白质荧光标记获得成功。
[0052]本发明提供的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法通过合成M.Barkeri物种的 吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列,并将所述DNA序列连接到pBK质粒上;通过 采用"饱和突变"的方法,构建了能够在原核和真核生物细胞中表达的M.Barkeri物种的吡 咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变库Lib-CouKRS;通过合成用于定点荧光标记的7-羟基香豆 素赖氨酸,进行筛选和验证,达到了基于7-羟基香豆素在真核生物(哺乳动物细胞)中实现 目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记。
[0053]以上仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技 术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法,其特征在于,所述基于7-羟基香豆素 的定点荧光标记方法包括如下步骤: S2:获得香豆素赖氨酸; S3:筛选特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(CouKRS)突变体; S4:在鲸鱼肌红蛋白Myoglobin-4TAG中插入7-羟基香豆素赖氨酸,验证筛选得到的 CouKRS能够实现在目的蛋白质制定位点插入。2. 如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法,其特征在于,所述步骤 S1包括如下步骤: 311:人工合成]\1.1^11^1^?711?3的0嫩序列; S12:将上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA连接到pBK质粒上,获得重组质粒A; 313:设计定点突变引物,所述定点突变引物包括引物卜¥3490、引物^¥3490、引物卜 L2701、引物r-L270I、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK; S14:以所述重组质粒A为模板,以所述引物f-Y349D和引物r-Y349D为引物,通过聚合酶 链式反应,获得突变库1; S15:以所述突变库1为模板,以所述引物f-L270I和引物r-L270I为引物,通过聚合酶链 式反应,获得突变库2; S16:以所述突变库2为模板,以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为引物, 通过聚合酶链式反应,获得突变库3; S17:以所述突变库3为模板,以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK为引物,通过聚合 酶链式反应,获得突变库4; S18:所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照预定的比例混合,获得用于7-羟基 香豆素筛选用的M.Barkeri PylRS突变库。3. 如权利要求2所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法,其特征在于,所述预定 的比例为1:1:32:32。4. 如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法,其特征在于,所述步骤 S2包括如下步骤: S21:取预设量的间苯二酚,溶于水中,并加热到90°C,滴加预设量的苹果酸,反应2小时 后即可得到7-羟基香豆素 A; S22:取预设量的上述7-羟基香豆素 A和赖氨酸于60°C搅拌,经过12小时;经液相色谱分 离,滤膜过滤除菌,得到7-羟基香豆素母液C。5. 如权利要求4所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法,其特征在于,所述7-羟 基香豆素母液C经过0.22微米滤膜过滤除菌。6. 如权利要求5所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法,其特征在于,所述7-羟 基香豆素母液C的浓度设定为100mM。7. 如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法,其特征在于,所述步骤 S3包括如下步骤: S31:构建和转化用于正筛选作用的pylT-pREP质粒; S32:构建用于表达验证的pylT-pBAD质粒,进行转化和筛选,获得能够特异识别7-羟基 香豆素赖氨酸CouKRS的菌株。8. 如权利要求7所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法,其特征在于,所述 CouKRS的突变位点为L2701,Y349D,N311A,N313G。9. 如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法,其特征在于,所述S4包 括如下步骤: S41:共转化 CouKRS-pBK 和 Myoglobin-4tag-pBAD 至 T0P10 中; S42:获得纯化的Myoglobin蛋白质; S43:将上述S42中获得Myoglobin蛋白质在488nm激光激发下,发出焚光,即可验证筛选 得到的CouKRS能够实现在目的蛋白质制定位点插入。
【专利摘要】本发明公开了一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法,通过合成M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列,并将所述DNA序列连接到pBK质粒上;通过采用“饱和突变”的方法,构建了能够在原核和真核生物细胞中表达的M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变库Lib-CouKRS;通过合成用于定点荧光标记的7-羟基香豆素赖氨酸,进行筛选和验证。本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法达到了基于7-羟基香豆素在真核生物(哺乳动物细胞)中实现目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记。
【IPC分类】C07K1/13
【公开号】CN105541962
【申请号】CN201510957190
【发明人】张贯京, 陈兴明, 张少鹏, 高伟明, 李慧玲, 潘延超
【申请人】深圳市贝沃德克生物技术研究院有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月19日
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