使用细菌毒素衍生的转运序列递送生物活性剂的系统和方法
【专利说明】
[00011 本申请是申请日为2011年9月15日，申请号为201180053563.1，发明名称为"使用 细菌毒素衍生的转运序列递送生物活性剂的系统和方法"的申请的分案申请。
[0002] 相关专利申请
[0003] 本申请要求2010年9月15日提交的美国临时申请号61/403,394的权益，通过引用 以其全文结合在此。
技术领域
[0004] 本发明的领域部分涉及用于新颖的药物应用的策略。更确切地说，本发明涉及霍 乱弧菌(Vibrio cholera)ChoIix基因的一种无毒突变体形式(ntCholix)、一种在氨基酸 A386处截短的Cholix变体(Cholix386)、以及其他不同的Cholix衍生的多肽序列用来增强生 物活性治疗剂的肠递送的用途。重要的是，在此所述的这些系统和方法提供了以下项:在没 有注射的情况下递送大分子剂量的能力;将负荷例如(但不限于）siRNA或反义分子递送至 其中需要它们的活性的细胞内区室中的能力；以及基于纳米颗粒和树枝状化合物的载体穿 过生物膜的递送，要不然该递送会由于大多数这种膜的屏障特性而将会受到阻碍。
【背景技术】
[0005] 大多数当前批准的小分子药物是穿过小肠粘膜而被吸收的，以便提供到体循环的 递送。事实上，小分子药物是基于它们穿过肠粘膜的稳定性和有效吸收而被选择。生物活性 多肽(指的是由氨基酸残基组成的聚合物，典型地定义为一种蛋白质或肽)的相似的口服递 送已经成为制药工业中的一个长期目标。因为胃肠(GI)道的目的是为了消化膳食蛋白质类 和肽类，存在着很多物理学、生理学、以及生物学屏障，这些屏障限制了以一种类似于用小 分子可完成的方式从肠摄取治疗性蛋白质和肽的可行性；马哈图(Mahato，R.I.)等人，《治 疗性药物载体系统评论》（Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，20(2_3):p. 153-214 (2003))〇
[0006] 已经鉴定了能够用来保护治疗性蛋白质和多肽通过胃的许多技术，允许它们到达 小肠中的上皮细胞的吸收表面并且将它们与发挥破坏膳食蛋白质类和肽类的作用的胃肠 环境分开。遗憾的是，然而由于在内腔表面的多肽的内涵体摄取之后通向破坏性溶酶体区 室的细胞内运输，穿过这种简单的、单层细胞的有效转运仍然是一个实质性屏障；伍德利 (Woodley,J.F·)，《治疗性药物载体系统评论》(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 11(2- 3) :p.61-95(1994))。的确，这种屏障的目的是为了抑制蛋白质类和肽类的摄取，直到这些 大分子可以充分地被降解以便通过氨基酸以及二肽或三肽转运蛋白而吸收。在此方面，已 经检验了克服肠粘膜的物理学、生理学、以及生物学屏障的多种努力。
[0007] 有两种穿过构成肠粘膜细胞屏障的单层上皮的基本途径。确切地说，一旦穿过覆 盖的粘液层，分子可以经由在内部运输细胞质内容物的、但不混合的一系列囊泡而在邻近 的上皮细胞之间移动(细胞旁路途径)或穿过细胞移动(跨细胞途径）；T. Jung等人，《欧洲制 药学与生物制药学杂志》(Eur J Pharm Biopharm,50:147-160(2000))。换言之，在两种途 径中，转运蛋白质或肽治疗剂不进入细胞而是停留在细胞的细胞质之外的环境中。
[0008] 治疗性蛋白质和肽通过细胞旁路途经的随机移动的主要屏障是在这些细胞的顶 颈部(apical neck)处的、称为紧密连接(TJ)的蛋白质复合物。虽然TJ结构的瞬时打开和关 闭可以促进转运肽穿过肠上皮，这种途径具有以下关键局限性:例如，它对于在约5kDa以上 的分子并非有效;它具有使物质从肠内腔非选择性地进入体内的潜力;并且它代表涉及肠 上皮表面区域的的仅仅一小部分的途径。
[0009] 蛋白质或肽治疗剂经由跨细胞途径穿过细胞而随机迀移的主要屏障是缺乏囊泡 运输，这种运输将这些囊泡的内容物递送至破坏性的（溶酶体的）路径中。当与细胞旁途径 相比较时，通过囊泡跨细胞途径的移动可以接纳直径大至IOOnm的物质，基本上涉及整个上 皮细胞表面，并且在通过使用用于囊泡进入的受体-配体互相作用的物质摄取中可以是高 度选择性的。因此，对于蛋白质或肽治疗剂的上皮转运而言，如果可以避免破坏性的路径， 则跨细胞途径是非常吸引人的。
[0010] 一些病原体已经解决了运输屏障问题，如通过分泌的多肽毒力因子(这些毒力因 子起到促进和/或稳定宿主感染的作用）的有效转胞吞作用所证明的。外毒素表示一类由许 多种微生物释放的蛋白质，它作为有力的毒力因子起作用。外毒素在多细胞生物上发挥作 用，具有充当在人类中的有力毒素的能力；罗斯扎克（Roszak，D.B.)，以及科尔威尔 (Colwell，R.R·)，《微生物综述》(Microbiol Rev 51: 365-379(1987))。这些蛋白质通常通 过涉及选择性破坏蛋白质合成的机制而杀死或灭活宿主细胞。因此，仅需要少数分子来杀 死细胞，与细菌外毒素是已知的最毒的毒剂中的一些的观察相一致。包括由来自白喉棒状 杆菌(Corynebacterium diphtheria)的白喉毒素(DT)、来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素 A(PE)、以及来自霍乱弧菌（Vibrio cholera)的最近鉴定的称为 Cho I ix的蛋白质组成的蛋白质家族的这些蛋白质的亚组经由延伸因子2 (EF2)的ADP-核糖 基化而起到使宿主细胞中毒的作用；耶茨(Yates，S.P.)等人，《生物化学科学动态》(Trends Biochem Sci，31:123-133(2006))。这些外毒素被合成为折叠成相异的结构域的氨基酸单 链，这些结构域已经被鉴定为具有在靶向、进入宿主细胞、以及使宿主细胞中毒方面的特殊 功能。
[0011 ] 最近已经描述了来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素 A(PE)的 生物学;Mrsny,R.J.，等人，《当代药物发现》（Drug Discov Today，7(4) :ρ·247-58(2002))。 PE是由613个氨基酸单链组成的，具有66828. IlDa的理论分子量(MW)、5.28的等电点（PI)， 并且它功能性地折叠成三个离散结构域，表示为结构域KAla1-Glu 252 K结构域IKGly253-Asn364)、结构域III (Gly4t35-Lys613，它包含ADP核糖基转移酶活性位点），以及连接结构域II 和结构域III的一个短的二硫键连接的环(该环称为Ib环）(Ala365-Gly4t34)。已经根据分辨率 约O A的晶体衍射确定了这些结构域在pH 8.0时的结构；卫德肯(Wedekind, J.E.)，等 人，《分子生物学杂志》(J Mol Biol ,314:823-837(2001))。结构域I(Ia+Ib)具有一个从13-股卷（13-stranded β-ro11)形成的核心，结构域II是由六个α-螺旋组成的，并且结构域 ΙΠ 具有复合的α/β-折叠结构。研究已经支持PE的模块性质允许不同的结构域功能的观点， 这些不同的结构域功能如下：结构域I结合至宿主细胞受体，结构域II涉及膜转位，并且结 构域III作为ADP核糖基转移酶起作用。显示PE可能是响应于环境线索和/或细胞信号由铜 绿假单胞菌在紧密靠近上皮细胞顶面处分泌的；Deng，Q.和巴比耶利(J.T.Barbieri)，《微 生物学年度评论》(Annu Rev Microbiol ,62 :ρ· 271-88(2008))。一旦分泌，在PE的结构域I 结合至膜蛋白α2-巨球蛋白（一种也称为低密度脂蛋白受体相关蛋白I(LRPl)或CD91的蛋白 质)之后发生进入细胞的内化;参见，例如菲茨杰拉德(FitzGerald，D. J.)，等人，《细胞生物 学杂志》(J Cell Biol, 129(6) :ρ· 1533-41(1995));考那斯(Kounnas，Μ·Ζ·)，等人，《生物化 学杂志》(J Biol Chem，267(18):p. 12420-3(1992))。在内化之后，PE避免运输至溶酶体而 是被有效地递送至细胞的基底面，在该基底面处PE以生物活性形式释放;Mrsny，R. J .，等 人，《当代药物发现》（Drug Discov Today ,7(4) :ρ· 247-58(2002))。一旦穿过上皮，PE通过 进入粘膜下层空间之内的CD91阳性细胞（巨噬细胞和树突细胞）中而起到毒力因子的作用， 在该粘膜下层空间内，PE进而与引起结构域III的细胞质递送的展开路径相交;参见，例如 马图（Mattoo，S·)、李(Υ.Μ. Lee)以及狄克逊(J.E .Dixon)，《当代免疫学观点》（Curr Opin Immunol，19(4) :p · 392-401 (2007));斯普纳（Spooner ,R.A.)，等人，《病毒学杂志》(Virol J,3:p.26(2006))〇
[0012] 霍乱弧菌细菌因与它齐名的毒性剂霍乱毒素 (CT)而最为熟知，霍乱毒素可以导致 急性的危及生命的大量水样腹泻。CT是一种蛋白质复合物，该复合物是由用B亚基五聚体组 织的单个A亚基组成，该B亚基五聚体结合至上皮顶面处的细胞表面Gm 1神经节苷脂结构上。 CT是在用携带溶源性噬菌体变体(称为CTXf或CTXcp)的霍乱弧菌毒株进行水平基因转移 之后由霍乱弧菌分泌的。然而最近的霍乱爆发已经表明某些血清型( n〇n-01，n〇n-0139)的 菌株不表达CT而是使用其他的毒力因子。non-01、non-0139的环境与临床数据的详细分析 表明一种与PE具有某种相似性的、新颖的假定的分泌外毒素的存在。
[0013] 约根森（Jorgensen,R.)等人，《生物化学杂志》（J Biol Chem，283(16): 10671-10678(2008))报道了霍乱弧菌的一些菌株事实上的确含有一种与PE具有相似性的、并且他 们将其称作Cholix毒素(Cholix)的蛋白质毒素。与PE相比，Cholix具有稍微较大的理论分 子量(70703.89Da)以及稍微更酸性的理论等电点（PI) (5.12)。634个氨基酸Cholix蛋白质 的晶体结构已经被解析至约2 A。发现该结构域结构以及组织有点类似于PE:结构域I (Val1-Lys265 )、结构域II (Glu266-Ala386)、结构域III (Arg426-Lys634)、以及Ib环（Ala387-Asn 425)。与PE相比的另外的结构相似性包括:用于细胞活化的弗林蛋白酶位点;可以将毒素 传递到宿主细胞内质网的C末端KDEL序列；以及在结构域III之内的ADP核糖基转移酶活性 位点。
[0014] 引人注目的是，通过氨基酸比对，PE和Cholix没有共享显著的遗传的和有限的相 似性。对于PE样核苷酸序列，搜索霍乱弧菌的基因组，没有导致任何种类的匹配。仅在蛋白 质序列水平存在PE样蛋白质可以由这种细菌产生的提示。即使这样，在PE与Cholix的氨基 酸序列之间仅有32%同源性，其中相似性(42%同源性)集中在结构域III的ADP核糖基化元 件中，并且对于两种蛋白质而言结构域I和II的大多数区段具有低水平的氨基酸同源性(约 15%-25%)。而且，相对于PE，Cholix的这种总体安排甚至更引人注目，因为具有相似元件 的这两种蛋白质是从两个不同的方向衍生的：铜绿假单胞菌是富含GC的细菌，而霍乱弧菌 富含AT。从两个不同遗传方向进化取得几乎相同的结构但仅有32%氨基酸同源性的这两种 毒素表明Cholix和PE的结构和功能的相似性可能是基于相似的生存压力而不是由于相似 的遗传背景。对于这两种蛋白质而言，结构域I和II的非常低的氨基酸同源性着重于这两种 蛋白质的折叠结构的功能重要性而不是它们的氨基酸序列。
[0015] Cholix和PE的C末端部分显得以可比较的方式通过EF2的ADP核糖基化而在细胞中 毒中起作用。其中通过接合至针对转铁蛋白受体的抗体而靶向于癌细胞的Cholix的后面一 半(结构域I缺失）的最近研究表明：涉及EF2的ADP核糖基化的PE和Cholix的C末端部分确实 在功能上是相似的