一种淋巴因子tal及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于应用海洋生物技术领域，具体涉及一种淋巴因子TAL及其编码基因和 应用。
【背景技术】
[0002] 香港牡(Crassostrea hongkongensis)主要分布在我国华南沿海众多的河口地 带，也是广东省沿海养殖最广泛贝类，有着个体大、味道美、营养丰富、具有食补功能等特 点，深受广大消费者喜爱，年养殖产量已达70多万吨，年产值约25-30亿元，是华南沿海海水 养殖支柱产业之一。但是，近年来随着养殖规模的不断扩大，养殖环境的破坏，以及病害的 频发，使得香港牡蛎出现了大规模死亡，严重制约了香港牡蛎养殖业的健康可持续发展。
[0003] 贝类血淋巴细胞是贝类免疫防御系统的核心和最重要的器官，通过参与细胞凝 集、吞噬作用、呼吸爆发和包囊化等过程起到免疫防御的作用。由于淋巴细胞生命短暂，贝 类生长发育过程中一直伴随着淋巴细胞的发生和分化。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种新的能促进牡蛎血淋巴细胞增殖的淋巴因子TAL及其编 码基因和应用。
[0005] 本发明的淋巴因子TAL，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006] 本发明还提供一种编码上述淋巴因子TAL的淋巴因子TAL基因。
[0007]优选，所述的淋巴因子TAL基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本发明还提供一种含有淋巴因子TAL基因的原核表达载体。优选，所述的原核表达 载体为pET_28a表达载体。
[0009] 本发明还提供一种含有包含淋巴因子TAL基因的原核表达载体的细菌。优选，所述 的细菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0010] 本发明还提供淋巴因子TAL在促进贝类血淋巴细胞增殖中的应用。
[0011] 所述的应用，优选包含将淋巴因子TAL注射到贝类闭壳肌的步骤。
[0012] 所述的贝类优选为香港牡(Crassostrea hongkongensis) 〇
[0013] 本发明通过筛选香港牡蛎转录组数据库，首次从香港牡蛎中分离一种淋巴因子 TAL，其基因全长660bp，编码219个氨基酸;通过功能分析和鉴定，发现香港牡蛎的淋巴因子 TAL可以促进血淋巴细胞的增殖，是一种新型的淋巴细胞生长因子。本发明中的淋巴因子 TAL具有显著的促进血淋巴细胞增殖作用，为贝类的病害防治和抗病育种提供了重要的理 论与实践依据。
【附图说明】
[0014]图1是纯化的淋巴因子TAL重组蛋白。M为蛋白Marker; 1为未诱导表达的蛋白；2为 IPTG诱导后表达的蛋白；3为纯化后的淋巴因子TAL重组蛋白。
[0015] 图2是淋巴因子TAL重组蛋白促进血淋巴细胞增殖的EdU增殖结果。ChTAL为淋巴因 子TAL重组蛋白组，BSA为对照组;Edu显示的是新增殖的血淋巴细胞，DAPI显示的是活的血 淋巴细胞，Merge是Edu和DAPI像的融合。
【具体实施方式】
[0016] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0017] 实施例1:
[0018] I. RNA 提取
[0019] 香港牡总RNA的提取使用TriZOl(Invitorgen)提取，具体步骤如下：（1)取50mg 香港牡蛎组织于液氮预冷的研钵中，将组织磨成粉末之后，转移到装有Iml Trizol的离心 管中，吹打、混匀；（2)加入200yL氯仿，剧烈震荡40s，室温放置511^11;(3)4°(3，12,000\8离心 IOmin，吸取上清转移至新管；（4)加入0.5ml的异丙醇，混匀，-80°C沉淀过夜；（5)4°C，12， OOOXg离心10min，弃上清；（6)75%乙醇清洗两次沉淀；（7)弃上清，加入50yL DEPC水溶解 RNA0
[0020] 2.CDNA文库构建
[0021] 全长cDNA文库构建使用GeneRacer? cDNA library construction Kit (Invitrogen)，其中5'RACE具体步骤如下：（1)牛肠磷酸酶(CIP)除去RNA的5'磷酸，用烟草 酸焦磷酸酶(TAP)去除，脱掉5 '磷酸基团RNA的5 '帽子结构；（2)用T4RNA连接酶将特异的一 段RNAOligo链接到RNA的5 '端；（3)用随机引物反转录生成5 'RACE第一条链;3 'RACE具体步 骤如下：用试剂盒提供的GeneRacer?01igo dT Primer为引物直接反转录生成第一条链;最 后检测cDNA文库滴度。
[0022] 3.原核表达载体构建
[0023] (1)根据香港牡蛎转录组数据库中筛选到的序列信息，设计一对包含香港牡蛎淋 巴因子TAL基因的 ORF 的特异性引物（ChTa I-F: ATGCGGATCCATGTCGACGGAGTATAGAAG; ChTal-R:ACTGCTCGAGTTACGCTGAATGCAGACTTT)，在引物两端分别添加 BamH I和Xho I酶切位点；（2) 使用这对引物，以构建好的cDNA文库为模板，PCR扩增出香港牡蛎淋巴因子TAL基因的ORF (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）；（3)PCR产物和pET-28a载体分别使用BamH-I和Xho-I 内切酶进行双酶切，利用琼脂糖凝胶电泳纯化酶切产物并回收；（4)将纯化后的酶切PCR产 物和酶切pET_28a载体连接；（5)将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆， 测序验证载体正确无误，测序结果表明如SEQ ID NO. 1所示的序列（淋巴因子TAL基因，共 660bp)插入了pET-28a载体中，由此得到含有淋巴因子TAL基因的pET-28a载体，进行后续原 核表达实验。淋巴因子TAL基因编码的淋巴因子TAL的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，含有 219个氨基酸。
[0024] 4.重组蛋白的原核表达和纯化
[0025] (1)提取步骤3的含有淋巴因子TAL基因的pET-28a载体，将其转化至大肠杆菌BL21 (DE3);(2)挑选单克隆并培养至0D = 0.6，加入IPTG至终浓度为0.1mM，37°C，200rpm的条件 下诱导表达；（3)4h后收集菌液，4°C，12，000Xg离心10min; (4)加入Lysozyme至终浓度2mg/ ml，冰浴下超声2-3个循环(超声4s，间歇4s，重复90次为一个循环)破碎细菌细胞；（5)使用 Ni-NTA纯化重组蛋白，在12 % SDS-PAGE胶分析纯化产物。其蛋白电泳结果如图1所示，大小 与理论值相符合，由此得到淋巴因子TAL重组蛋白。
[0026] 5.血淋巴细胞EdU增殖测定
[0027] 分别将I OOyL (100mg/ml)香港牡蛎淋巴因子TAL重组蛋白和I OOyL (100mg/ml) BSA 注射到香港牡蛎闭壳肌，其中BSA作为对照组；12h后每个组随机取10只香港牡蛎。利用EdU 标记技术检测血淋巴细胞的增殖。具体步骤如下：（1)从上述随机抽取的香港牡蛎中取出血 淋巴细胞以每孔1106接种于6孔板中；（2)在每孔中加入IOum的EdU，室温避光孵育2小时； (3)PBS清洗细胞2次，每次3分钟；（4)加入ImL 4%的多聚甲醛室温孵育10分钟；（5)PBS清洗 细胞2次，每次3分钟；（6)加入ImL含0.5%TritonX-ΙΟΟ的PBS室温孵育10分钟，然后I 3BS清洗 细胞2次；（7)加入500uLClick-iT?反应液室温避光孵育30分钟；（8)弃Click-iT?反应液， 用含有3%的BSA的PBS清洗细胞；（9)加入500uL稀释的DAPI试剂，室温避光孵育10分钟，然 后弃染色液，用PBS清洗三次；（10)荧光显微镜下镜检观察。结果如图2所示，注射淋巴因子 TAL重组蛋白组比注射BSA组的新增殖的血淋巴细胞数量明显要多，结果表明淋巴因子TAL 重组蛋白能显著的促进血淋巴细胞增殖。
【主权项】
1. 一种淋巴因子TAL，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. -种编码权利要求1所述的淋巴因子TAL的淋巴因子TAL基因。3. 根据权利要求2所述的淋巴因子TAL基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。4. 一种含有权利要求2所述的淋巴因子TAL基因的原核表达载体。5. 根据权利要求2所述的原核表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体为pET-28a 表达载体。6. -种含有权利要求4所述的原核表达载体的细菌。7. 根据权利要求6所述的细菌，其特征在于，所述的细菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。8. 权利要求1所述的淋巴因子TAL在促进贝类血淋巴细胞增殖中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包含将淋巴因子TAL注射到贝类闭壳肌的 步骤。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的贝类为香港牡(Crassostrea hongkongensis)〇
【专利摘要】本发明公开了一种淋巴因子TAL及其编码基因和应用。本发明首次从香港牡蛎中分离一种淋巴因子TAL，其编码基因全长660bp，编码219个氨基酸；通过功能分析和鉴定，发现香港牡蛎的淋巴因子TAL可以促进血淋巴细胞的增殖，是一种新型的淋巴细胞生长因子。本发明中的淋巴因子TAL具有显著的促进血淋巴细胞增殖作用，为贝类的病害防治和抗病育种提供了重要的理论与实践依据。
【IPC分类】C12N15/19, C12N15/70, A61P37/02, C12N1/21, C07K14/52, C12R1/19, A61K38/19
【公开号】CN105541995
【申请号】CN201610024181
【发明人】李军, 张扬, 喻子牛, 刘映, 张跃环
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月13日