脂蛋白相关磷脂酶a2单克隆抗体、抗体对及制备方法、用图
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体、抗体对及制备方法、用途。
【背景技术】
[0002]脂蛋白相关磷脂酶A2由PLA2G7基因编码，又被称为血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)，属于磷脂酶家族中PLA2的一种，是丝氨酸依赖的磷脂酶，其催化活性不需要Ca2+。人血浆脂蛋白相关磷脂酶A2的分子量为45KDa，其主要由巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、肝细胞等分泌生成，并受到炎性介质的调节。比如，γ-干扰素和脂多糖抑制其分泌，血小板活化因子促进其分泌。脂蛋白相关磷脂酶Α2的主要作用包括:产生十二烷酸类炎性物质、参与磷脂重建及生物膜的稳定平衡、脂蛋白代谢、细胞信号传递、宿主反应、促进机体坏死组织自体消失。
[0003]急性心脑血管疾病是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型。近年来，随着对动脉粥样硬化研究的不断深入，许多炎性因子被发现，炎性已经被公认是动脉粥样硬化发展过程中的核心因素。传统的炎性标志物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子、纤维蛋白原、C反应蛋白等，在促进动脉粥样硬化斑块形成中的作用逐渐被众多实验所证实。脂蛋白相关磷脂酶Α2作为一种新近研究的炎性反应介质，具有促进动脉粥样硬化作用，与心脑血管事件的发生有密切关系，为心脑血管疾病的诊断增添了一种新的手段，并成为治疗该类疾病新的潜在目标靶点。
[0004]目前关于脂蛋白相关磷脂酶Α2的研究报道越来越多，急需开发出特异性强的抗体用于脂蛋白相关磷脂酶Α2的检测。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明的目的是提供性能优良的脂蛋白相关磷脂酶Α2单克隆抗体；
[0006]本发明的另一目的是提供由蛋白相关磷脂酶Α2单克隆抗体组合而成的抗体对。
[0007]本发明的另一目的是提供脂蛋白相关磷脂酶Α2单克隆抗体、抗体对的制备方法。
[0008]本发明的另一目的是提供脂蛋白相关磷脂酶Α2单克隆抗体的用途。
[0009]本发明的另一目的是提供由脂蛋白相关磷脂酶Α2单克隆抗体组合而成的抗体对的用途。
[0010]本发明通过实验验证了抗体的效果和序列测定，为脂蛋白相关磷脂酶Α2的检测提供了性能优良的单克隆抗体，且适用于作为诊断试剂盒开发的抗体原料。
[0011]为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案:脂蛋白相关磷脂酶Α2单克隆抗体，分别为 CSB-DAl 13BmN ①、CSB-DA113BmN ②和 CSB-DA113BmN ③；
[0012]CSB-DAl13BmN①轻链可变区部分核苷酸序列如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所述；
[0013]CSB-DAl13BmN①重链可变区部分核苷酸序列如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所述；
[0014]CSB-DAl13BmN②轻链可变区部分核苷酸序列如SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9所述；
[0015]CSB-DA113BmN②重链可变区部分核苷酸序列如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所述；
[0016]CSB-DA113BmN③轻链可变区部分核苷酸序列如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所述；
[0017]CSB-DA113BmN③重链可变区部分核苷酸序列如SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.15所述。
[0018]脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤:
[0019]步骤一、采用多种表达系统表达脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白，重组脂
[0020]蛋白相关磷脂酶A2序列如序列表SEQID N0.1所述；
[0021]步骤二、分离纯化步骤一中各表达系统表达的脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白；
[0022]步骤三、将步骤二之后的脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白进行混合后免疫宿主动物；
[0023]步骤四、取所述免疫宿主动物的脾脏细胞制备融合细胞；
[0024]步骤五、采用所述融合细胞制备脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体。
[0025]作为进一步的优选，在步骤一中，各表达系统分别为大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。
[0026]作为进一步的优选，在步骤一、二中，脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在大肠杆菌表达系统中的表达和分离纯化，具体包括如下:
[0027]A、合成SEQ ID N0.1的基因序列以及相应亚克隆引物(引物序列如序列表SEQ IDN0.2和SEQ ID N0.3所述)，并连接至pUC18质粒，以此质粒为模板，进行PCR扩增Lp_PLA2基因；
[0028]B、双酶切pET28a表达质粒以及PCR产物，I %琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物；
[0029]C、采用T4 DNA连接酶连接回收后的载体和PCR产物，T4 DNA连接酶的反应条件为16°C 连接 8h-16h;
[0030]D、连接产物转化DH5a感受态细胞，涂布于含卡拉霉素的LB固体培养基，将培养皿置于37°C培养箱培养8h-16h;
[0031]E、挑取若干单菌落，特异引物进行菌落PCR鉴定，PCR产物经过跑琼脂糖凝胶电泳，选取条带大小为1300bp左右对应的菌落进行基因测序；
[0032]F、编号为1、3、4和10对应的菌株基因测序结果正确，将四株菌株经扩大培养，提取其中重组质粒，然后转化至E.coli BL21表达菌株，转化成功的菌株分别命名为Lp-PLA2-BL21-1、Lp-PLA2-BL21-3、Lp_PLA2_BL21-4和Lp_PLA2_BL21-10；
[0033]G、将四种表达菌种接种于3mL LB液体培养基中37°C，200rpm过夜培养，取200yL培养液添加200yL 30%甘油，均匀混合后置于-80°C，作为工作种子备用；取30yL过夜培养菌液加入到含3mL LB培养基中，37°C震荡培养至0D600约0.6，加入IPTG诱导剂至终浓度
0.5mM，继续37°C震荡培养3hr ；
[0034]H、取Iml诱导培养的菌液，12000g X 30s离心收获菌体，用10yL I % SDS重悬，混匀，100°C加热1min ；然后12000g离心1min，取上清进行SDS-PAGE分析；
[0035]1、经过 SDS-PAGE 分析 Lp-PLA2-BL21-l、Lp-PLA2-BL21-3、Lp-PLA2-BL21-4 和 Lp-?1^2-81^1-10蛋白产量分别为2.1、3.8、2.5和4.311^/1^，取产量最高的14)-?1^2-81^1-10进行放大试验；
[0036]J、取保存于-80°C的Lp-PLA2-BL21-10菌种20yL转接入20mL液体LB培养基，37°C，200rpm过夜培养；取20mL过夜培养菌液加入到含2000mL LB培养基中，37°C震荡培养至0D600约0.6，加入IPTG诱导剂(终浓度0.5mM)，然后降低温度到30°C继续培养3h；
[0037]K、收集发酵液，6000g离心1min收集菌体，将菌体悬浮于40mL预冷的NTA-0(20mMTris-HCl，500mM NaCl，pH8.0)缓冲液，然后超声波破碎细菌，控制功率为300W，超声4s，暂停4s，超声90次，最后20000g，4°C离心30min，收集上清以及细胞碎片；
[0038]L、取少量上清和细胞进行SDS-PAGE检测，剩余上清过N1-NTA层析柱，纯化得到分子量为45kDa目的蛋白。
[0039]作为进一步的优选，在步骤一、二中，脂蛋白相关磷脂酶A2重组蛋白在酵母表达系统中的表达和分离纯化，具体包括如下:
[0040]A、合成序列表I的基因序列以及相应亚克隆引物(引物序列如SEQ ID N0.2和SEQID N0.3所述)，并连接至pPIC9K质粒，得到的连接产物转化到感受态菌E.coli TOPlOjMt后将菌液涂布于含50yg/mL卡拉霉素和lmg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，将培养皿置于37°C培养箱培养12h，挑选单菌落PCR和双酶切验证正确后，进行测序，得到测序正确的重组子；
[0041 ] B、将上述测序正确的三个重组子接种到含3mL LB液体培养基，200rpm，37°C培养8-16h，无菌条件下吸取200yL菌液保种，剩下的2.8mL菌液接种于300mL LB液体培养基(含50yg/mL卡拉霉素和lmg/mL氨节青霉素)，200rpm，37°C培养12h，然后大提质粒，质粒纯度99%以上，浓度在1ygAiL左右；
[0042]C、用Sacl酶对上述大提质粒进行线性化，37°C水浴过夜后回收线性化质粒，然后用Eppendorf电转化仪分别电转化(电压1500V，时间5ms)线性化质粒于GS115感受态中；涂布150uL转化后的菌液于(lmg/mL G418) RDB固体培养基，30°C培养4_5天；
[0043]D、小量表达筛选:从RDB平板上挑选20株单菌落，PCR扩增目的基因PLA2G7，琼脂糖凝胶电泳大小正确的条带鉴定为阳性，得到17个阳性菌落，挑取这些菌落接种于1.5mL YPG液体培养基的试管中，30°C，200r