融合蛋白sumo1-pla2及制备方法和医用用图
【技术领域】
[0001 ]本发明提供一种融合蛋白SUM01-PLA2及制备方法，本发明还提供了该SUMOl化融合蛋白的医用用途，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]SUMOCSmall ubi quit in-re lated modifier)即小泛素相关修饰物，是一种新发现的广泛存在于真核生物中的蛋白质翻译后修饰形式，在生命活动中发挥着重要的作用。在体内SUMO化修饰所起的作用包括调节蛋白质之间的相互作用、调节蛋白质在核与质的相互转运以及对细胞周期的调控等。由于SUMO化修饰的底物蛋白都是一些非常重要的细胞周期调控蛋白，如p53，PML和RanGAPl等，因此SUMO化与去SUMO化过程在细胞内发挥着非常重要的生物学功能，制备出高灵敏的底物及分析方法是进行相关研究的关键。
[0003]磷脂酶A2(ph0Sph0lipaSe A2, PLA2)是参与细胞代谢活动、信号转导等过程的重要酶类之一，广泛分布于哺乳动物机体内。磷脂酶是指催化水解磷脂酰、溶血磷脂酰化合物中的羧酸酯键、磷酸酯键和磷酸与胆碱之间酯键的一类脂酶。PLA2可催化水解细胞膜甘油磷脂类的sn-2位酯键从而生成脂肪酸和溶血磷脂。花生四烯酸是其中重要的一种，介导体内一系列病理生理过程，如机体的抗菌抗病毒过程、关节炎、动脉粥样硬化、哮喘、鼻炎、血栓形成等。近期研究还发现，PLA2与巴特综合征、神经轴突营养障碍、新生儿坏死性小肠结肠炎等疾病均具有密切关系。
[0004]磷脂酶A2中有大量的二硫键，这可能影响了其在大肠杆菌中的有效表达，另外，目前磷脂酶A2在大肠杆菌中多以包涵体形式表达，对蛋白的纯化带来不便，其反应原性和免疫原性亦不如可溶性蛋白好。所以，目前PLA2蛋白的体外有效表达、纯化是PLA2蛋白应用过程的难点。因PLA2能水解甘油磷脂类的sn-2位酯键的特点，许多人工sn-2位连接荧光基团的脂类是PLA2活性的方便灵敏的产物，但PLA2的活性受其N端序列空间位阻的影响，利用此特点，本研究鸡的SUMOI分子融合于PLA2的N端，应用原核表达纯化出SUMO1-PLA2蛋白，此时融合的PLA2无水解底物活性，当去SUMO化酶水解除去PLA2的N端SUMOI分子解除空间位阻，使PLA2活性，水解人工脂类底物，从而用来分析去SUMO化酶的活性。
【发明内容】
[0005]本发明公开一种融合蛋白SUM01-PLA2，克服了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题。
[0006]本发明进一步提供了融合蛋白SUM01-PLA2的制备方法，利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUM01-PLA2，克服现有方法中PLA2蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。
[0007 ]本发明又提供了融合蛋白SUMOl -PLA2的医用用途，在体外系统中检测去SUMO化酶活性，并且公开了此蛋白作为去SUMO化酶底物的使用方法。
[0008]本发明的目的在于提供一种利用pColdTF表达载体高效表达PLA2蛋白的方法，该方法能够高效表达可溶性的SUMO融合的PLA2蛋白，并且表达产物的免疫学反应活性更佳。
[0009]本发明所述的一种融合蛋白SUM01-PLA2，其特征在于:
其的氨基酸序列如SEQ n0.1所示。
[0010]本发明所述的融合蛋白SUM01-PLA2的制备方法，包括以下步骤:
I)鸡SUMOl基因的获取，具体步骤如下:
提取鸡细胞全基因组
以鸡细胞全基因组为模板设计引物，在引物中引入几个碱基，使之人为的加入一个AgeI的酶切位点，这样当用去SUMOl化酶切割的时候在PLA2的N端没有任何多余的氨基酸，不影响PLA2的水解活性，为去SUMOl化酶活性的分析打下了基础；并且在引物的上游加上Nde頂每切位点，用于原核表达的构建；
所用引物为:
上游引物:CATATG ATGTCG GACCAG GAAGCA AAG下游引物:ACCGGT CTGTT CCTGAT AAACTTC
以鸡细胞全基因组为模板，上述两条引物，PCR法扩增得到鸡SUMOl基因序列，图1所示，P为鸡SUMOl基因的PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结果，经测序完全正确。
[0011 ] 2)鼠源性PLA2基因的获取方法，步骤如下:
以小鼠细胞全基因组为模板设计引物，在引物中引入了一个甘氨酸(GGA)使之成为SUMOl分子中双甘氨酸的一部分，并且在引物的上游加上AgeI酶切位点，下游加上XhoI酶切位点，用于原核表达的构建；
所用引物为:
上游引物:ACCGGT GGAGGA CTCCTG GAGCT下游引物:CTCGAG TCAATT GCACTT GGGAGA GTC
以小鼠细胞全基因组为模板，上述两条引物，PCR法扩增得到PLA2基因序列，图2所示，Q为鸡SUMOl基因的PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结果，经测序完全正确。
[0012]3)SUM01_PLA2融合蛋白基因全长的构建，步骤如下: 将上述?0?产物31]]?01和?1^2分别用则61^861>86^1101两组
酶酶切，回收大片段;将原核表达载体PColdTF用Nde1、XhoI双酶切回收大片段;三个回收的片段在T4 DNA酶的作用下构建成pColdTF-SUM01-PLA2;其中NdeI和XhoI两酶切位点之间的序列即为融合基因SUM01-PLA2。
[0013]2、本发明所述的融合蛋白SUM01-PLA2的制备方法，具体步骤如下:
I)融合蛋白TF-SUMO1-PLA2的原核表达
将构建完成的pColdTF-SUM01-PLA2重组质粒，转入到BL21 (DE3)原核表达菌体系，37°(3终浓度0.1 mM IPTG诱导表达融合蛋白。
[0014]2)TF-SUM01_PLA2融合蛋白原核表达产物纯化
非变性条件下，Ni亲和层析一步法纯化融合蛋白TF-SUM01-PLA2，利用不同浓度的咪唑对融合蛋白TF-SUMOl -PLA2进行洗脱纯化，经过透析、浓缩收集以用于去SUMO化酶切割的蛋白，如图3所示。
[0015]3、融合蛋白作为去SUMO酶底物的用途用来作为人、哺乳动物及鸟类去SUMOl化酶的活性分析，应用去SUMO化酶SENPl对融合蛋白TF-SUMO1-PLA2进行了成功的酶切分离，见图4;通过去SUMO化酶水解SUMO与PLA2间的肽键释放PLA2，再由PLA2水解带有荧光基团的价格低廉的脂类底物NBDC6-HPC，可以产生一种荧光底物NBD，通过检测荧光强度分析去SUMO化酶的水解活性，此信号逐级放大过程可提高检测的灵敏度，见图5。
[0016]本发明的积极效果在于:提供了一种新的SUMOl化融合蛋白，解决了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题;利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUM01-PLA2，克服现有方法中PLA2蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。
【附图说明】
[0017]图1为1%琼脂糖凝胶电泳显示SUMOl基因片段的调取；
图2为1%琼脂糖凝胶电泳展示融合蛋白PLA2基因的获取；
图3为10% SDS-PAGE电泳图展示Ni亲和层析后的融合蛋白TF-SUMO1-PLA2 ；
图4为去SUMO化酶SENPl对融合蛋白的酶切；
图5为对PLA2水解NBDC6-HPC产生荧光的监测。
【具体实施方式】
[0018]通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
[0019]实施例1
基因扩增与融合
本发明所述融合基因SUMO1-PLA2全长的获取
1、鸡SUMOI基因的获取，步骤如下:
检索鸡SUMOl基因全序列。(来源于NCBI核酸数据库)
鸡SUMOl核酸序列
I ATGTCGGACCAGGAAGCAAAGCCTTCAGCTGAGGACTTAGGAGATAAGAAAGAGGGGGAATACATTAAACTCAAAGTCATTGGGCAGGACAGCAGTGAAATTCACTTCAAGGTGAAAATGACAACACACCTCAAGAAACTCAAAGAATCATACTGTCAAAGACAGGGTGTTCCAATGAACTCACTCAGGTTTCTCTTCGAGGGTCAGAGAATTACTGATAATCATACCCCCAAGGAGCTGGGGA288 TGGAGGAGGAAGATGTGATTGAAGTTTATCAGGAACAGACCGGT蛋白序列
I MSDQEAKPSAEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQRQGVPMNS96 LRFLFEGQRITDNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQTG提取鸡基因组，PCR法获得SUMOI基因序列。
[0020]上游引物1:
CATATG ATGTCG GACCAG GAAGCA AAG下游引物2:
ACCGGT CTGTT CCTGAT AAACTTC PCR反应条件:
1、95°C3 min
2、94°CI min； 58°C 30 s； 72°C I min； 30 cycles
3、72°C10 min
4、4°Cstore
2、鼠源性PLA2-基因的获取具体过程如下:
检索小鼠PLA2基因全序列。(来源于NCBI核酸数据库)
PLA2序列基因全长
I GGAGGACTCCTGGAGCTGGCAGGGACCTTGGATTGTGTTGGGCCTCGATCTCCGATGGCTTACATGAACTATGGCTGTTATTGTGGCCTTGGTGGCCATGGAGAGCCACGTGACGCCATTGACTGGTGCTGCTACCACCACGACTGCTGCTACTCT