一种富含有机质的微生物样品的保存试剂、包含该保存试剂的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物分子生态学领域，特别是设及一种富含有机质的微生物样品的 保存试剂、包含该保存试剂的试剂盒及其应用;本发明还设及富含有机质的微生物样品的 保存试剂的使用及检测试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002] 在富含有机质的环境中，无论是数量还是种类，其中的微生物都尤为丰富。由于环 境中富含有机营养物质，样品在采集后，样品中的微生物仍然可W利用其中的营养物质，继 续生长繁殖。但由于采样后，样本所处的环境已被改变，此时，若样品中的微生物继续生长 繁殖，其中微生物的菌群结构就会发生改变。某些类群的微生物更适应"新"的环境，从而大 量繁殖;而某些类群的微生物由于条件改变后不利于其生长繁殖，其在样品中的数量就会 减少，甚至慢慢消失。此时若对样品进行微生物多样性的研究，就会与实际情况相差较大， 得到的结果也就不够准确，无法如实反应自然状态下微生物的分布，也无从了解运些微生 物在自然环境中发挥的作用。
[0003] 目前最理想的样品保存方法，是将采集到的样品立即冷冻于液氮或-80°C冰箱内。 就其效果而言，冻存在液氮或者-80°C冰箱中的样品，的确能够在一段时间内（一周W上 )保持样品中的细菌构成结构不会发生显著的变化。然而其最大的缺陷在于，低溫冻存条 件苛刻且难于实现。例如外出采样者，采得的±壤、粪便等样品，需要随身携带一段时间才 能够带回实验室冻存;或者采样者与实验室不在同一地点，需要在采样后通过快递等方式 寄送到实验室后才可冻存。而在运整个过程中，微生物的构成很可能已经发生了改变。
【发明内容】
[0004] 为了解决W上问题，本发明提供一种富含有机质的微生物样品的保存试剂的配 方，及包含该保存试剂的试剂盒和使用方法。按照配方所述配置保存试剂，将采集的样品按 照一定的比例置于相应体积的保存试剂中，无需冻存，即可达到稳定其中微生物组成的作 用。在室溫甚至更高溫度条件下（37°C)，保存时间长达14天之久，从而使样品的保存、运输 变得更加容易，对于样品的保护也更加安全、简便、易于实现。
[000引为达上述目的，本发明一种富含有机质的微生物样品的保存试剂，其包含W下成 分： pH缓冲液、微生物细胞保护剂、馨合剂W及离子强度维持剂，其中所述保存试剂中抑缓 冲液pH值为7.0~8.5，微生物细胞保护剂浓度为5%-40%，所述馨合剂浓度为100-250mM，所述 离子强度维持剂浓度不低于lOmM。
[0006] 其中所述缓冲液为化is-HCl缓冲液或PBS缓冲液的一种，浓度范围为50-500 ml。
[0007] 其中所述微生物细胞保护剂为二甲基亚讽。
[000引其中所述馨合剂为乙二胺四乙酸。
[0009] 其中所述离子强度维持剂为氯化钢溶液、氯化钟溶液或碳酸氨钢溶液的一种。
[0010] -种制备所述富含有机质的微生物样品的保存试剂的方法，按比例将微生物细胞 保护剂、馨合剂、离子强度维持剂完全溶解于缓冲液中，充分混合均匀配置成所需微生物保 存试剂。
[0011] -种包含所述的富含有机质的微生物样品的保存试剂的试剂盒。
[0012] -种包含所述的富含有机质的微生物的保存试剂用于保存富含有机质的微生物 样品的应用，所述富含有机质的微生物样品的重量(g):保存试剂体积(mL)优选为1: 1-1: 10,保存时间优选为0-14天。
[0013] 其中将富含有机质的微生物样品加入本发明设及的富含有机质的微生物样品的 保存试剂中，在室溫条件下保存或在-80-37°C环境下保存。
[0014] 其中所述富含有机质的微生物样品为:粪便样品，优选为人的粪便样品、或牛/羊/ 大鼠/小鼠的粪便样品；含粪便的样品，优选为牛粪肥、人或动物肠道内容物;±壤样品，优 选为沙±、黏±、陶±、底泥、壤±、泥炭±、农田±壤、改良±、堆肥;渺泥、沉积物等;微生物 发酵物，优选为发酵饲料、发酵食品;微生物培养物，优选为菌液或菌体。
[0015] 本发明与现有技术不同之处在于本发明取得了如下技术效果： (1) 本发明的富含有机质的微生物样品的保存试剂，含有DMS0,对其中的微生物起到保 护作用； (2) 本发明加入了较高浓度的抗凝剂，能够保持其中微生物在样品采集后即进入"静 止"，不再进行生长繁殖，最大程度地保持样品的原始状态，保证其中微生物的种类、比例、 数量均不发生变化； (3) 本发明中的缓冲液，提供必要的离子缓冲能力，更有利于后续DNA的提取、检测及 PCR扩增等后续实验操作。
[0016] 下面结合附图对本发明作进一步说明。
【附图说明】
[0017] 图la和化为不同志愿者粪便细菌总DNA提取效果随时间延长的效果图； 图2a和化为不同粪便细菌16S rRNA基因的PCR扩增效果图； 图3a、3b、3c和3d分别为不同处理的粪便样本中细菌A1曲a多样性比较图； 图4a和图4b为不同处理的粪便样本中细菌物种间PCoA分析图，图4a为PCoA(wei曲ted Unifric);图4b为PCoA(unwei曲ted Unifric); 图5曰、56、5(3、5(1和56分别为在口、纲、目、科、属各水平上，不同处理的粪便样本中细菌 丰度组成比较图，图5a为口水平，图5b为纲水平，图5c为目水平，图5d为科水平，图5e为属水 平。
【具体实施方式】
[0018] 下面W粪便样本为例，对本发明的富含有机质的微生物的保存试剂的实施方案进 行详细描述。下面的实施例仅用于说明本发明。实施例中未注明具体的技术或条件，按照本 领域内的文献描述的技术条件或者按照产品说明书进行。
[0019] 实施例1:富含有机质的微生物样品的保存试剂的制备。
[0020] 按照配方，首先用去离子水配置合适浓度的缓冲液，再按照体积比，加入适量的细 胞保护剂、馨合剂和离子强度维持剂，放在磁力揽拌器上，充分混合均匀，使得最终所述保 存试剂中pH缓冲液pH值为7.0~8.5，微生物细胞保护剂浓度为5%-40%，所述馨合剂浓度为 100-250mM，所述离子强度维持剂浓度不低于lOmM室溫保存。
[0021] 实施例2:粪便样本的收集及不同保存时间的处理。
[0022] 采取两个志愿者的新鲜粪便(取后排出的中间部分，避免粪便表面的黏膜，能更好 得体现肠道微生物类群），分别分装为12管，其中3管立即冻存于-80°C，作为平行实验及正 对照;在其余9管中加入该发明所述的保存试剂，置于37°C水浴锅中，恒溫保存3天，7天，14 天。取样后立即冻存于-80°C冰箱，用于后续基因组抽提。
[0023] 实施例3:粪便样本中细菌总DNA保存效果实验。
[0024] 采取QIAamp DNA Stool Mini Kit进行基因组抽提，电泳检测进行质控，结果如图 la和化所示，浓度为10-20ng/uL。
[00巧]实施例4:粪便样本中细菌16S rRNA基因 PCR扩增效果实