一株产井冈霉素的黄麻链霉菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一株产井冈霉素的黄麻链霉菌 (Streptomyces corchorusii)，本发明还设及该菌株的应用。
【背景技术】
[0002] 井冈霉素是一种农用抗生素，能有效防治纹枯病，是"防效高、无药害、无污染"的 环保型农药，是当今产量和使用面积最大的农用抗生素。井冈霉素属于氨基糖巧类，主要由 A、B、C、D、E、F等组分组成，后来又发现G和H等成份，但只有A组分对纹枯病的防治作用最强， 高含量井冈霉素 A不仅可W作为农药使用，还可W作为生产医药的中间体，其应用前景十分 广阔。然而目前采用微生物发酵方法生产的井冈霉素杂质含量较高，尤其是井冈霉素 B的含 量较高，产品质量普遍较差。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是通过对黄麻链霉菌株进行人工诱变，从而获得一株不仅能用于生 产井冈霉素，而且能提高井冈霉素 A含量，降低井冈霉素 B含量的黄麻链霉菌。
[0004] 申请人W黄麻链霉菌化N-11)为出发菌株，将其采用lOOOGy剂量60C0- 丫射线进行 第一轮诱变，获得一株KN-16菌株，该菌株比出发菌株的效价(产井冈霉素 A的含量）高出 21%，然后再用紫外线对脚-16菌进行第二轮诱变，获得一株剛-162菌株，比脚-16的效价提 高9.8%。将KN-162菌株进行再一次抗性筛选，用高纯度、杂质含量低的自身代谢物处理该 菌株，杀死或抵制绝大多细胞的繁殖，选出有大量产生该代谢物的抗反馈突变株，得到1株 正突变KN-1625菌株，该菌株产井冈霉素 A的含量比KN-162菌株高18%，产井冈霉素 B/A的 含量比1^-162菌株低约37.56%。
[0005] 该菌株经鉴定为黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii)，命名为KN-1625,申请 人于2015年11月26日将该菌保藏于位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏 中屯、(CCTCC)，保藏编号为CCTCC N0:M 2015710。
[0006] 为验证KN-1625菌生产井冈霉素的性能，申请人将KN-1625菌株投入生产并进行了 两批次的中试研究，首先将KN-1625菌株进行活化，活化后的菌悬液进行二级种子培养，培 养液再进入发酵罐进行发酵，放罐后用高效液相色谱法对发酵液进行检测，结果表明：发酵 液中井冈霉素 A的含量高达3.065%，井冈霉素 B与井冈霉素 A的含量比（B/A)仅为11.52%， 与出发菌株化N-11)相比，井冈霉素 A含量提高了47.00%，B/A降低了37.56%，且井冈霉素 产量稳定在300(K)yg/mLW上，比CK菌株也有所提高。试验结果还表明，KN1625菌株的遗传稳 定性好，传至四代产井冈霉素水平与第一代相当。
【具体实施方式】
[0007] W下结合具体实施例对本发明进行详细地说明。
[000引实施例1菌株的诱变和筛选
[0009] 1.利用60C0- 丫射线处理菌悬液W得到突变菌株
[0010] 取黄麻链霉菌KN-11的斜面细胞或抱子适量，置于含有玻璃珠的无菌水中，使其细 胞或抱子浓度在106~108个/毫升，充分摇匀打散。由于丫射击线穿透能力很强，对细胞致 死作用比一般化学诱变剂更为强烈。诱变剂量掌握在致死率90-99%为宜，WKN-16为出发 菌株，将其抱子菌悬液用不同剂量60C0-丫射线福照，剂量为300Gy、500Gy、700Gy、1000Gy、 130067、150067时，分别致辞死率为75.7%、85.3%、89.1%、95.0%、98.2%、99.10%。 300Gy内处理抱子死亡率上升的非常快，500-1500Gy处理抱子死亡率变化相对缓慢。
[0011] 诱变剂量不同，对KN-11的突变率也不同。诱变剂量过大，正突变很低，将700Gy、 1000Gy、1300Gy、1500Gy诱变后的菌悬液稀释进行平板计数，在诱变后的菌斑上加入2毫升 无菌水，浸泡0.5小时，用1毫升移液器反复吹洗菌斑数次后转移至无菌试管中，W此管为 10-1管，依次做10倍稀释涂布。28°C恒溫培养5天，观察长势，挑选菌落直径大、长势快、吸水 快的、菌苔饱满中间凸起的菌落进行摇瓶筛选，在lOOOGy诱变剂量中获得一株KN-16菌株， 产量与出发菌株化N-11)相比，效价高出21%。
[0012] 2.利用紫外线诱变处理筛选突变菌株，W得到少数性能优良的菌株
[0013] 经过60C0-丫射线诱变后的菌株，大多数细胞死亡，但有少数细胞中的DNA发生突 变，将运些突变后的菌株再次进行紫外诱变，可W影响DNA损伤的修复作用，使之出现更多 的差错，提高诱变率，其诱变频率高且不易回复，紫外线可引起微生物菌体的DNA突变，形成 喀晚二聚体。光照会断开二聚体，所W紫外线诱时要避光条件下进行。W前认为致死率在 90-99.9%效果好。但是目前的报道认为致死率在70-80%有利于正突变型的产生，且筛选 的菌株遗传稳定性好。
[0014] 将KN-16菌制成10X108个/ml单抱子悬液，取2ml到直径为90mm的无菌平板中，在 磁力揽拌下进行紫外线诱变(波长253.7皿，功率15W，照射距离30cm)，照射时间分别为0,2， 5，8，10，15，20，25min，然后取经过不同剂量照射的菌悬液0.1 mL到平板培养基上28°C恒溫 培养5天，待菌落长出后进行活菌计数，并绘制致死曲线，在得到致死曲线后，用致死率在 80-90%的照射时间照射菌株，再次28°C恒溫培养5天。将致死率在90-95%的菌株稀释并涂 布到含有最大耐受井冈霉素 A浓度的菌株上，28°C恒溫培养5天，将长出的菌落编号摇瓶测 定井冈霉素 A的含量及B组分的含量，获得一株KN-162菌株，摇瓶比KN-16菌株产井冈霉素 A 含量高9.8%。
[00巧]3.通过抗性筛选得至崎产井冈霉素 A、B组份低的菌株
[0016]井冈霉素 A为氨基糖巧类抗生素，是放线菌的次级代谢产物，其代谢途径复杂，研 究表明，抗生素发酵受反馈抑制非常明显，特别是氨基糖巧类抗生素。次级代谢产物是某些 生物为了避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利 于生存的代谢类型。由于次级代谢和初级代谢有共同的分差中间体，既可W合成初级代谢 产物，又可W合成次级代谢产物。当菌体生长的环境中营养物质不均衡时，即某些营养过 剩、某些营养缺乏，菌体不能有效的摄入营养，在代谢系统的作用下，其生长繁殖速率下降， 并通过代谢途径的改变将过剩的营养物质转变成与生长繁殖无关的次级代谢产物。因此， 在筛选菌株时，我们就W消除初级代谢产物对那些共同中间体的反馈调节，使之大量积累， 运样就有利于井冈霉素 A的合成，降低杂质含量。
[0017]将KN-162菌株进行再一次抗性筛选，用64A高纯度、B/A为18%杂质含量低的自身 代谢物井冈霉素 A(标准品）按不同浓度(有效含量0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.