一株铜绿假单胞菌及其在生产蛋白酶中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于工业微生物领域，具体设及一株来源于深海海泥的铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)，及其在生产蛋白酶中的应用。
【背景技术】
[0002] 海洋是生命的发源地，占地球表面积的70%，拥有地球80%的生物资源。海洋一般 具有高盐、高压、寡营养、低溫等特点，海洋微生物为了适应运些极端环境，在长期的进化过 程中所形成的一些代谢产物和活性物质与陆生微生物存在着一定差异。
[0003] 微生物蛋白酶是一类W水解蛋白质肤键为特点的水解酶，在人类的生产、生活中 扮演着相当重要的角色。随着基因工程和发酵技术的迅速发展及广泛应用，利用微生物发 酵技术产酶已经成为生产商品酶制剂的主要方法。而在极端环境下生存的海洋微生物所产 的蛋白酶一般具有耐盐、抑值和溫度范围较宽等特点。耐盐微生物或耐盐蛋白酶因其在高 盐环境下仍能生长，并保留有较高活性，故在污水处理、酱油发酵等领域受到研究者的青 睐。
[0004] 长期W来，铜绿假单胞菌是一种重要的工业微生物，常被应用于生产鼠李糖脂、溶 解铜绿微囊藻、降解石油、苯酪污染物等研究领域。但目前所发现利用的铜绿假单胞菌主要 来源于陆地，而来源于深海海泥，并能产高酶活、高耐盐稳定性蛋白酶的菌株却鲜有报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的是提供一株来源于深海海泥的、可产高酶活高耐盐特性蛋白酶 的菌株--铜绿假单胞菌(Pseudomonas ae;ruginosa)SWJSS3。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述菌株在生产蛋白酶中的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[000引铜绿假单胞菌菌株SWJSS3,已于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中屯、，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保 藏编号为CGMCC No.10973。
[0009] 对上述菌株进行形态学及生理生化鉴定，有W下特征：
[0010] 表1菌株形态特征
[0011]
'[0014]~注:表1和2中，V'表示90% w上菌株
呈阳性，"-"表示90% w上菌株呈阴性。 '
[0015] 经提取和测序，菌株SWJSS3的16S rDNA的长度为1387bp，其序列为沈Q ID No.l。
[0016] 将获得的16S rDNA序列输入到Genbank，应用blast程序将其与数据库中的基因序 列进行比对。结果显示其与铜绿假单胞菌16S rDNA序列的同源性为100%。
[0017] 将16S rDNA的序列比对结果结合菌株形态学及生理生化鉴定特征，确定该菌株为 一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株，并命名为SWJSS3。
[0018] 菌株SWJSS3可用于液体发酵生产蛋白酶，其发酵方法包括W下步骤：
[0019] 在发酵罐中加入发酵培养基，装液量为8-12 %，初始抑值为7.0-7.5，菌株接种量 为0.8-1.2%，罐内初始溫度20~40°C，振荡条件下发酵30-8化，罐内会产生大量蛋白酶，分 离提取得到蛋白酶。
[0020] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0021 ] 1、本发明的菌株SWJSS3产蛋白酶能力强，所得蛋白酶具有高酶活、高耐盐特性。
[0022] 2、本发明提供的菌株SWJSS3发酵方法条件简单，遗传性质稳定，适用于工业化生 产。
【附图说明】
[0023] 图1为不同发酵溫度对菌株SWJSS3产蛋白酶的影响。
[0024] 图2为不同发酵时间对菌株SWJSS3产蛋白酶的影响。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0026] 实施例所用到的培养基其配方如下：
[0027] 1、富集培养基(g/L人工海水）：①蛋白腺5.0;②酵母提取粉1.0;③憐酸铁0.1;④ 氯化钢100;⑤抑值7.2~7.6。
[00%] 2、种子培养基(g/L人工海水）：①蛋白腺5.0;②酵母提取粉1.0;③憐酸铁0.1;④ pH 值 7.2 ~7.6。
[0029] 3、筛选培养基(酪蛋白平板）（g/L人工海水）：①酪蛋白10;②牛肉浸粉3.0;③憐酸 二氨钟2.0;④琼脂粉15;⑤抑值7.2~7.6。
[0030] 4、发酵培养基：①葡萄糖4 ;②甘油8 ;③酵母提取粉15 ;④K2HPO4O . 2 ;⑤吐溫- 800.5;⑥海盐10;⑦去离子水化;⑧抑值7.5左右。
[0031] 5、试管斜面培养基：①牛肉膏4;②蛋白腺6 ;③酵母提取粉2;④海盐5 ;⑤琼脂粉 15;⑥去离子水化;⑦抑值7.2~7.6。
[0032] 实施例1
[0033] 菌株SWJSS3的分离、筛选和鉴定，包括W下步骤：
[0034] 富集:称取Ig海泥于50血加有玻璃珠的灭菌离屯、管中，加入10血0.9%的无菌生理 盐水后置于摇床中振荡培养30min使其充分分散，取ImL上清液于富集培养基中，37°C、 180r/min恒溫培养2地。
[0035] 初筛：取2次富集后的培养液ImL用0.9%的无菌生理盐水将其梯度稀释为1〇-1、10 Λ?0-3;个浓度，从中各取100化加注到已凝固的酪蛋白平板上，涂布均匀，倒置在37°C恒 溫培养箱中培养2地。挑取有明显水解圈的单菌落，反复划线Ξ次后接种到试管斜面培养基 并保存于4°C冰箱中。
[0036] 复筛:将上述保藏在试管斜面上的纯培养物活化Ξ次后接种到种子培养基中，于 37°C、18化/min恒溫振荡培养箱中培养12h，W1 %接种量接种到发酵培养基中，相同条件下 培养4她，取出离屯、，取上清液即得粗酶液。粗酶液做适当稀释后测其酶活。
[0037] 粗酶液耐盐稳定性实验:取一定量具有酶活的粗酶液稀释5倍与化C1混合，使盐浓 度为15%，W相同处理方式但不加 NaCl的粗酶液为对照，4°C冰箱中放置不同时间，分别测 其残余酶活，计算相对值：
[003引相对酶活％ =加 NaCl的残余酶活/不加 NaCl的粗酶酶活
[0039] 结果如表3所示：
[0040] 表3蛋白酶耐盐菌株的筛选情况
[0041]
[0042] 通过酪蛋白水解圈筛选及发酵液酶活测定，将酶活高于20U/mL的10株菌的发酵液 稀释5倍配成终浓度为15%的化C1溶液，混匀后存放于4°C冰箱，3h后测其残余酶活，W不加 化C1的菌株发酵液酶活为对照，计算相对酶活值（％)，结果如表3所示，从表中可W看出菌 株A3的相对活力最高，为40.70%，所W确定A3为后续实验的研究对象，将其编号为SWJSS3。
[0043] 菌株SWJSS3的鉴定：
[0044] 将活化的菌株接种于LB培养基中，37°C、180巧m培养12h，取1.5ml新鲜菌液4°C， 1000化pm离屯、lOmin，取菌体于2ml离屯、管中，采用DNA提取试剂盒提取DM。电泳检测后采用 通用引物进行PCR扩增其16S rDNA序列。
[0045] 引物序列为：
[0046] 正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（沈Q ID No.2)
[0047] 反向引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'（SEQ ID No.3)
[004引扩增总反应体系（5化L)，包括：模板基因 DM 1.上下游引物（20皿ol/L)各 2.扣レhq DNA聚合酶0.扣レ10 X buffer 5.0化;4种脱氧核巧酸混合物dNTP(各2.5mmol/ L)4. OyL，25mmo 1/L MgCl24.0化，双蒸水（d地20)30.2扣L。
[0049] PCR反应程序采用两步法：第一步预变性94°C、2min，变性98°C、10s，退火55°C、 Imin，延伸68°C、30s(25个循环），最后一次延伸时间延长到lOmin。
[(K)加]PCR产物纯化后完成测定的16S rDNA基因片段长度为1387bp，其序列为SEQ ID No. 1，与数据库中Pseudomonas aeruginosa的不同菌株的16S rDNA序列具有100%的序列 相似性。
[0051 ]结合菌株形态学(表1)、生理生化特征(表2)，确定菌株SWJSS3为一株新的铜绿假 单胞菌（Pseudomon曰S 曰eruginos曰）。
[0化2]实施例2
[0053] 菌株SWJSS3在生产蛋白酶中的应用，包括W下步骤：
[0054] (1)发酵溫度优化，采用上文的发酵培养基，分别在培养箱溫度为20°C、25°C、30 °C、37°C、40°C、45°C下，初始抑值为7.5，装液量为10 %，接种量为1 %的条件下，培养4她后 离屯、测酶活，结果如图1，从图中可W看出该菌株在溫度为20°C~40°C时都有一定的产酶 量，但在25°C时产酶量最高。
[00对 （2)发酵时间优化，在30°C，pH值为7.5，装液量为10 %，ISOrpm条件下发酵，从0- 80h，每隔化连续取样，测其中的生物量和蛋白酶活随发酵时间的变化趋势。
[0056] 结果如图2,从图中可W看出：菌株生长在20h后已进入稳定期。培养1化之后菌株 开始大量产酶，酶产量在30h后进入稳定期，其中在36h时达到最大，之后趋于稳定。
[0化7]实施例3
[005引菌株SWJSS3的遗传稳定性研究
[0059] 将菌株SWJSS3连续传代培养5次，并测其蛋白酶活力，作为评价遗传稳定性的指 标。
[0060] 结果如表4，传代培养5次，蛋白酶活力都保持在750U/ml左右，表明其遗传稳定性 良好。
[0061] 表4菌株传代酶活
[0062]
[0063]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 铜绿假单胞菌菌株SWJSS3,已于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏 编号为CGMCC No .10973。2. 权利要求1所述的菌株SWJSS3在生产蛋白酶中的应用。3. 根据权利要求2所述的菌株SWJSS3在生产蛋白酶中的应用，其特征在于包括以下步 骤： 在发酵罐中加入发酵培养基，装液量为8-12 %，初始pH值为7.0-7.5，菌株接种量为 0.8-1.2%，罐内初始温度20~40°C，振荡条件下发酵30-80h，罐内会产生大量蛋白酶，分离 提取得到蛋白酶。
【专利摘要】本发明公开了一株铜绿假单胞菌菌株SWJSS3及其在生产蛋白酶中的应用，该菌株已于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC？No.10973；该菌株用于生产蛋白酶时包括以下步骤：在发酵罐中加入发酵培养基，装液量为8-12％，初始pH值为7.0-7.5，菌株接种量为0.8-1.2％，罐内初始温度20～40℃，振荡条件下发酵30-80h，罐内会产生大量蛋白酶，分离提取得到蛋白酶。本发明的菌株SWJSS3产蛋白酶能力强，所得蛋白酶具有高酶活、高耐盐特性；本发明提供发酵方法条件简单，遗传性质稳定，适用于工业化生产。CGMCC No.1097320150610
【IPC分类】C12R1/385, C12N1/20, C12N9/52
【公开号】CN105543147
【申请号】CN201610073533
【发明人】赵谋明, 苏国万, 舒会, 赵强忠
【申请人】华南理工大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月1日