一种鲫鱼脑组织细胞系及其应用
【技术领域】
[0001 ]本申请涉及鲫鱼细胞培养领域，特别是涉及一种鲫鱼脑组织细胞系及其应用。
【背景技术】
[0002]鲫鱼在分类上属鲤科、鲤亚科、鲫属。鲫鱼在我国各地均有分布。有两个亚种及多个变种:鲫亚种(Carassius auratus L)和银鲫(Carassius auratus gibel1 Bloch)亚种；以及红鲫、白鲫、金鱼等多个变种。在我国淡水鱼养殖业以及观赏鱼养殖业中，鲫鱼占有十分重要的地位。因此，从细胞生物学、分子生物学、形态学、遗传育种学等多方面展开对鲫鱼的研究，意义重大。
[0003]鲫鱼(Carassius auratus Linnaeus)的脑位于顶骨的下方，由端脑、间脑、视叶、小脑和延脑五部分构成，全长约20mm，面积约160mm2，控制着鲫鱼的嗅觉、视觉、味觉和运动系统，是鲫鱼的最高中枢神经系统。同时，鲫鱼的脑组织也是多种病毒的靶器官，比如锦鲤疱疹病毒CyHV-1型、CyHV-2型、CyHV-3型均可感染鲫鱼，造成脑组织的病变。
[0004]目前从鲫鱼组织分离的细胞系仅有鲫鱼囊胚胚胎细胞(CAB)、鲫鱼鳍条细胞系，尚没有鲫鱼脑组织细胞系的相关研究和报道。但是，如前面提到的，感染鲫鱼的多种病毒都是以鲫鱼的脑组织为靶器官的；鲫鱼脑组织细胞系相关研究和报道的缺乏，极大的限制了鲫鱼病毒病症的深入研究和疫病防治。
【发明内容】
[0005]本申请的目的是提供一种鲫鱼脑组织细胞系及其应用。
[0006]为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案:
[0007]本申请一方面公开了一种鲫鱼脑组织细胞系，该鲫鱼脑组织细胞系为鲫鱼脑组织中分离的鲫鱼脑组织细胞，鲫鱼脑组织细胞系的保藏号为CCTCC N0.C2015159。
[0008]本申请的鲫鱼脑组织细胞系中，鲫鱼脑组织细胞为上皮样的星形胶质细胞。
[0009]本申请的鲫鱼脑组织细胞系能稳定连续传代至少80代。
[0010]本申请的另一面公开了本申请的鲫鱼脑组织细胞系在鲫鱼病毒的培养和/或检测中的应用。
[0011]需要说明的是，本申请的鲫鱼脑组织细胞系，能够稳定传代，可以作为鲫鱼病毒的培养、检测的宿主细胞，以便深入的研究鲫鱼病毒，例如对鲫鱼病毒进行培养，以便后续研究，或者培养后进行检测等。本申请中，鲫鱼病毒是指感染鲫鱼的病毒，尤其包括以鲫鱼脑组织为靶器官的病毒。
[0012]本申请的还公开了本申请的鲫鱼脑组织细胞系作为研究水产动物病毒的宿主细胞的应用。以及本申请的鲫鱼脑组织细胞系在水产动物病毒的分离中的应用。
[0013]可以理解，本申请的鲫鱼脑组织细胞系虽然是主要针对鲫鱼病毒而研究的，但是，其并不仅限于作为鲫鱼病毒的宿主细胞，也可以作为其它水产动物病毒的宿主细胞，用于对水产动物病毒进行深入研究，或者培养后分离相关病毒或副产物。本申请中水产动物病毒是指对水产动物进行感染的病毒，包括但不仅限于鲫鱼病毒。
[0014]由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于:
[0015]本申请的鲫鱼脑组织细胞系，填补了鲫鱼脑组织细胞系研究的空白，为感染鲫鱼的病毒提供了一种新的研究工具，特别是为以鲫鱼脑组织为靶器官的病毒的深入研究奠定了基础。
[0016]本申请的鲫鱼脑组织细胞系命名为鲫鱼脑星形胶质细胞系CAA，英文全称Carassius Auratus Astrocyte，简称CAA。本申请的鲫鱼脑组织细胞系的保藏号为:CCTCCN0.C2015159;分类为:动物细胞系;保藏时间为:2015年9月23日；保藏单位是:中国典型培养物保藏中心;保藏地址是:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
【附图说明】
[0017]图1是本申请实施例中培养的鲫鱼脑组织细胞系的倒置相差显微镜的观察结果图；
[0018]图2是本申请实施例中鲫鱼脑组织细胞系在不同温度下的生长曲线图，图中右手边曲线末端由上到下的曲线为28°C下的生长曲线、25°C下的生长曲线、20°C下的生长曲线、15°C下的生长曲线；
[0019]图3是本申请实施例中鲫鱼脑组织细胞系的GFAP蛋白免疫荧光检测结果图；
[0020]图4是本申请实施例中鲫鱼脑组织细胞系的第80代细胞周期分布图；
[0021]图5是本申请实施例中鲫鱼脑组织细胞系表达外源基因的荧光显微镜观察结果图。
【具体实施方式】
[0022]感染鲫鱼的病毒中，有多种都是以鲫鱼的脑组织为靶器官的；但是，现有技术中并没有鲫鱼脑组织细胞系的相关研究和报道;这极大的限制了以鲫鱼脑组织为靶器官的病毒的研究。本申请的发明人在长期的研究和实践中，提出了该问题，并率先研究出了分离自鲫鱼脑组织中的鲫鱼脑组织细胞系，从而提出了本申请。
[0023]本申请的鲫鱼脑组织细胞系填补了鲫鱼病毒研究的空白，尤其是方便了以鲫鱼脑组织为靶器官的病毒的深入研究，为相关病毒的检测、疫病防治等奠定了基础。
[0024]此外，本申请的鲫鱼脑组织细胞系为上皮样的星形胶质细胞，具有很强的增殖能力和活性，正常的二倍体核型，对外源基因有高效率的表达，为感染鲫鱼的病毒性病原分离提供了一种新型的、稳定的、高敏感性的细胞模型，为进一步研究鲫鱼病毒的感染发病机理，提供了一种新的分子细胞水平理论研究的平台。特别是目前对鲫鱼造成极大危害的CyHV-2型病毒。
[0025]下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例和附图仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
[0026]实施例
[0027 ] 一、鲫鱼脑组织细胞系的构建与保藏
[0028]1.组织分离
[0029]1.1培养基配置
[0030]全功能培养基:在基础培养基L-15中，依次加入20 %胎牛血清、25ng/mL的人表皮生长因子、2mmol/L的L-谷氨酰胺、100IU/mL的青霉素、100yg/mL的链霉素、1%的虹鳟鱼血清。以上浓度均为各组份在全功能培养基中的终浓度，百分比为体积百分比。
[0031 ] PBS 缓冲液:取 8.0Og NaCl, 0.20g KCl，2.03g Na2HPO4.12H20，0.10g KH2PO4 溶于三蒸水定容为100mL，115°C高压灭菌20min，置于-4°C冰箱备用。
[0032]消化液:用于细胞消化传代的胰蛋白酶购自美国Sigma公司，将0.25g胰酶溶于I OOmL的PBS，过滤除菌，置于-20°C冰箱备用。
[0033]D-Hank ’ s液:取8.0Og NaCl, 0.40g KCl，0.13g Na2HPO4.12H20，0.06g KH2PO4,
0.35g恥!10)3，0.1(^酚红溶入三蒸水配制成10001^，115°(3高压灭菌201^11，置于-4°(3冰箱备用。
[0034]本例的基础培养基L-15和胎牛血清购自GIBCO公司，人表皮生长因子、青霉素和链霉素购自Sigma公司，L-谷氨酰胺购自Merk公司，虹鳟鱼血清购自美国caisson labs。
[0035]1.2动物和组织来源
[0036]本例采用的鲫鱼为4-5cm的幼年健康鲫鱼。先用冰块使鲫鱼进入无知觉状态，然后在75 %的乙醇中浸泡I Omin，准备采取组织。
[0037]1.3组织分离
[0038]在无菌状态下用剪刀剪开鲫鱼顶骨，打开脑腔，用镊子小心的分离出脑组织，迅速放入事先准备好的含有1000IU/mL的青霉素和1000yg/mL的链霉素冰冷的PBS中，清洗干净；剥离脂肪组织，然后将脑组织在含有1000IU/mL的青霉素和1000yg/mL的链霉素冰冷的PBS中剪成2mm的小块，用含有1000IU/mL的青霉素和lOOOyg/mL的链霉素冰冷的PBS充分清洗后，放置于含有0.1 % XIV型链酶蛋白酶的消化液中，37°C振荡消化15min;消化完全的组织悬液用400目的网筛进行过滤，收集滤液，缓缓的将滤液放入无菌的25cm2细胞培养瓶中，细胞培养瓶购自美国BD公司，添加配置好的全功能培养基，定容至5mL，显微镜下观察细胞密度和状态，判断细胞的活力以及密度能否第二天铺满细胞瓶，一般采用活细胞计数法统计细胞数量，达到I X 16个/mL即可，随后放入细胞培养箱培养，培养温度为28°C，无需CO2。
[0039]2.原代培养
[0040]每天观察细胞生长情况，待生长大约2?3天，可见细胞铺满细胞瓶底部，形态似铺路石状，即获得原代的鲫鱼脑组织细胞。
[0041]3.传代培养
[0042]原代细胞在大约5天左右，进入生长平台期，此时弃去旧的培养基，用2mL缓冲液D-Hank ’ s液(PH = 7.0)，清洗细胞，清洗完后，再加入0.25 %胰蛋白酶和0.02 % EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到贴壁细胞变圆，细