分泌抗马铃薯y病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种分泌抗马铃馨Υ病毒单克隆抗体的杂交 瘤细胞株及其单抗的应用。
【背景技术】
[0002] 马铃馨Υ病毒(Potato virus Y，PVY)是危害马铃馨、烟草等农作物的重要病毒之 一，在全球广泛传播并造成严重经济损失。PVY是马铃馨Y病毒科(Potyviridae)马铃馨Y病 毒属(Potyvirus)的代表成员，1931年由Smith在马铃馨中首次发现。马铃馨Y病毒属是植物 病毒中最大的属，确定和可能的种约有200个，该属的病毒能侵染茄科、襲科、豆科、葫芦科 等多种植物并造成重大的经济损失。自1953年起PVY在欧洲马铃馨种植区广泛流行，20世纪 70年代该病毒扩展到美洲，到上世纪90年代初该病毒在亚洲开始发生流行，目前该病毒在 世界各地均有发生危害。PVY引起的症状因寄主品种和病毒株系的不同而有所差异，典型的 症状包括重型花叶、叶脉坏死、垂叶条斑坏死等，可引起马铃馨产量损失高达80%。研究发 现PVY的初侵染源主要是带毒种馨，病原通过种馨调运可作远距离扩散，在马铃馨田块PVY 也可W通过病汁液和携毒晒虫传播。PVY粒子为弯曲线状，无包膜，大小为730Xllnm，基因 组全长约10化，5'-末端共价结合基因组连接病毒蛋白（genome-linked viral protein, VPg)，3'-末端有Ploy(A)。基因组只包含1个大的ORF，编码1个约360W)a的多聚蛋白，该多聚 蛋白可裂解成11个成熟的功能蛋白，其中包括一个29.8kDa的外壳蛋白。
[0003] 防治PVY主要采用抗病毒育种和生产无毒种馨的方法，而快速、准确、灵敏、特异的 病毒检测技术是抗病毒育种和生产无毒种馨的关键。与常规的指示植物检测、电镜检测、分 子生物学检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模检测等优点。目前 已有关于PVY抗体制备和血清学方法的报道，但已报道的PVY抗体和血清学方法的检测灵敏 度欠佳，为此，本发明W纯化的PVY病毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了 1株分泌抗PVY 的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株，W分泌的单抗为核屯、建立检测PVY的高通量的血清学方 法及试剂盒，从而为我国PVY的检测和诊断、流行病学的调查、无毒种馨的生产、病毒基因组 功能的分析及其科学防控体系的建立提供物质和技术支持。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗马铃馨Y病毒单抗的杂交 瘤细胞株及其单抗应用。
[000引分泌抗马铃馨Y病毒单抗杂交瘤细胞株3B2，它能分泌抗马铃馨Y病毒单抗，杂交瘤 细胞株3B2于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏 号为CGMCC No.12001。
[0006] -种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃馨Y病毒单抗，抗马铃馨Y病毒单抗腹水间 接ELISA效价达1〇-7，抗体类型及亚类为IgGl、ka卵a轻链，与马铃馨Y病毒30邸a的外壳蛋白 有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染马铃馨Y病毒 病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:10 240倍稀释(w/v，g/mL)。
[0007] 抗马铃馨Y病毒单抗与感染马铃馨Y病毒的植物组织有特异性免疫反应，而与感染 马铃馨A病毒、马铃馨X病毒、马铃馨S病毒、马铃馨卷叶病毒及健康的烟草和马铃馨叶片组 织均不发生免疫反应。
[0008] 抗马铃馨Y病毒单抗在该病毒检测上的应用是W单抗为核屯、建立的各种免疫学检 测方法及免疫学试剂盒。
[0009] 本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株能大量稳定分泌 抗PVY特异、灵敏的单抗，W分泌的单抗为核屯、建立的ACP-化ISA、dot-化ISA和Ti SSUe blot-ELISA等血清学方法及用运些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测植物 中的马铃馨Y病毒;2)利用本发明所制备的单抗检测PVY，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪 等设备;3)利用本发明所制备的单抗，可有效地用于田间植物中PVY的检测和诊断，也可用 于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、脱毒种馨生产、抗性育种、科学防控等 方面。
【附图说明】
[0010] 图1 dot-ELISA方法检测马铃馨Y病毒的特异性分析。
[00川图2 dot-ELISA方法检测PVY的灵敏度分析。
[0012]图3 dot-ELISA方法检测田间植物样品中PVY的结果。
[001引图4 RT-PCR方法对检测田间植物样品中PVY的结果。
[00M] 图5 Tissue blot-ELISA方法田间检ii植物样品中PVY的结果。
[001引生物保藏
[0016]杂交瘤细胞株3B2于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中屯、，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100 101，保藏号为CGMCC No.12001。
【具体实施方式】
[0017] 分泌抗马铃馨Y病毒单抗杂交瘤细胞株3B2，它能分泌抗马铃馨Y病毒单抗，杂交瘤 细胞株3B2于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏 号为CGMCC No.12001。
[0018] -种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃馨Y病毒单抗，抗马铃馨Y病毒单抗腹水间 接ELISA效价达ΙΟΛ抗体类型及亚类为IgGUka卵a轻链，与马铃馨Y病毒30邸a的外壳蛋白 有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染马铃馨Y病毒 病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:10 240倍稀释(w/v，g/mL)。
[0019] 抗马铃馨Y病毒单抗与感染马铃馨Y病毒的植物组织有特异性免疫反应，而与感染 马铃馨A病毒、马铃馨X病毒、马铃馨S病毒、马铃馨卷叶病毒及健康的烟草和马铃馨叶片组 织均不发生免疫反应。
[0020] 抗马铃馨Y病毒单抗在该病毒检测上的应用是W单抗为核屯、建立的各种免疫学检 测方法及免疫学试剂盒。
[0021] 本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗PVY单抗，且该细胞株分泌的单抗特异 性强、效价高、稳定性好、灵敏度高。W该单抗为核屯、建立检测PVY的高通量的血清学方法可 成功应用于田间植物中PVY的检测，从而为我国马铃馨Y病毒病检测和诊断、脱毒种馨的生 产、科学防控提供物质和技术支持。
[0022] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
[0023] -、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
[0024] 1.免疫原及检测抗原的制备
[0025] 用下面的操作步骤提纯病毒粒子：
[0026] 1)将组织匀浆器在冰上预冷；
[0027] 2)称取感染PVY的烟草组织200g，每lOOg组织加入200mL 0.5M憐酸盐缓冲液即PB 缓冲液(含0.01M化-EDTA和0.1 %琉基乙醇，pH 7.5)，在组织匀浆器中匀浆5-lOmin，使烟 草组织充分匀浆，用双层棉纱布过滤匀浆液，滤液6 00化pm离屯、20min去除植物残渣；
[002引 3)所得的离屯、上清液在揽拌中加至终浓度为2.5 % Triton X-100、4 %阳G(分子量 为6 000)和0.1M NaCl，然后4°C揽拌4hW上；
[0029] 4)11 000巧m 离屯、15min 去上清；
[0030] 5)用 lOmL pH 7.5 的 0.5M PB(含 0.01M MgC12 和 0.5M 脈）将沉淀充分悬浮，6 00化pm离屯、15min后将上清收集于烧杯中，放置于4°C，沉淀再悬浮、离屯、，重复3次；
[0031 ] 6)将上述离屯、上清液合并，33 000巧m超速离屯、lOOmin;
[0032] 7)所得沉淀用0.5M PB悬浮后8 00化pm离屯、15min，收集上清液，沉淀再悬浮、离 屯、，重复3次；
[0033] 8)将合并上清液加到超离管中，用注射器针头吸取20mL 30%薦糖加到超离管的 底部形成薦糖垫，33 000巧m超速离屯、lOOmin;
[0034] 9)所得沉淀用适量pH 7.5的0.01M PB(含0.01M MgC12)悬浮，33 OOOrpm超速离屯、 lOOmi