一种酯酶phe21及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工和生物技术领域，具体设及一种醋酶P皿21及其编码基因和 应用。
【背景技术】
[0002] 手性化合物是一类由相同原子组成，立体结构互为镜像的一类化合物，在生物学 和药学性质上具有较大的差异。如己比妥酸盐S-(-)异构体具有抑制神经活动的作用，而R- (+ )异构体却具有兴奋作用;苯并吗啡烧的2个对映体都有镇痛作用，但(-)的异构体服用后 会成癒，而(+ )的异构体则不会;R型的"反应停"是孕妇用镇痛药和止痛药，而S型的"反应 停"对胎儿则有致崎作用;右旋甲状腺素钢可作为降血脂药物应用，但左旋体对屯、脏具有严 重的副作用;抗菌药氧氣沙星的右旋体能损害肝、肾功能，但左旋的氧氣沙星药效很高，且 毒性极小，其在各国上市后，深受人们的欢迎。
[0003] 手性化合物的合成主要有：（1)化学法，即利用对映体的物理和化学性质的差异进 行分离。通常有盐析法、包结法W及组合拆分。其缺点是要求对映体之间的性质差异要大， 适用的化合物不多。（2)色谱拆分，运种方法是利用填料对手性对映体吸附性质的差异来实 现，其缺点是设备昂贵，普及性较差。（3)合成法，通过设计反应来进行手性化合物的化学合 成。运种方法缺点在于反应过程通常比较剧烈，耗费能量，而且反应中使用大量有毒的有机 溶剂。
[0004] 醋酶化sterase，EC 3.1.1 .X)，是一种催化醋键水解和合成的酶的总称。水解时， 其催化醋键产生甘油和脂肪酸;合成时，可将酸的簇基与醇的径基脱水缩合，产物为醋类及 其他香味物质。其来源非常广泛，微生物、植物和动物中都有存在。醋酶作为生物催化剂多 数可作用非天然底物，而且可拆分的底物多，立体选择性高，不需要辅助因子，是一种重要 的手性催化剂。
[000引光学纯3-径基下酸乙醋化皿)是精细化工中制备多种手性产品的关键中间体，应 用十分广泛。其中，（S)-巧皿)是薰衣草醇、食菌甲诱醇、核球壳菌、格哈菌素、卡包霉素和灰 绿霉素前体等天然产物的手性源；（R)-巧皿)则是合成手性药物的重要中间体，如β-内酷胺 酶抑制剂，1^-肉碱、亚胺培南等碳青霉締类抗生素等。但由于生产技术和生产成本方面的原 因，在我国绝大多数的合成药物仍然还是W外消旋体形式出现的。
[0006] 生物酶具有立体位点区域和底物的高度专一性，利用酶促反应催化具有反应条件 溫和、位点选择性强、副反应少、光学纯度高W及环境污染小等优点，因此开发具有光学选 择性的醋酶具有重要的意义。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术中脂肪酶价格昂贵、生产技术受到制约的不足，提供一种新 的醋酶Ρ肥21及其编码基因和应用。
[000引本发明从一株海洋假单胞菌（Pseudomonadaceae oryz;Lhabitans)HUP022中开发 了 一种新的醋酶P皿21及其编码基因 P皿21，构建了含有P皿21的重组表达载体和基因工程 菌，培养基因工程菌后获得醋酶PHE21，其可应用于催化醋类反应和制备(5)-3-?基下酸乙 醋。
[0009] 本发明的第一个目的是提供一种醋酶P肥21，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种编码所述的醋酶P肥21的醋酶基因 P肥21。
[0011] 优选，所述的醋酶基因 P肥21的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 本发明还提供一种含有所述的醋酶基因 P肥21的重组表达载体。所述的表达载体， 优选为祀T28a( + )载体。
[0013] 本发明还提供一种含有所述的醋酶基因 P肥21的基因工程菌。所述的基因工程菌， 优选为大肠杆菌化21 (DE3)。
[0014] 本发明的第Ξ个目的是提供所述的醋酶P皿21在催化醋类水解、醋化或转醋化反 应中的应用。
[0015] 优选，所述的醋酶P肥21在催化拆分（±)-3-径基下酸乙醋反应得到（5)-3-?基下 酸乙醋中的应用。
[0016]本发明的第五个目的是提供所述的醋酶PHE21在耐受钢盐、Co2\K+、Zn 2\正戊醇 和/或Triton-XlOO环境下进行催化的应用。
[0017]本发明的醋酶基因 PHE21来自深海样品中筛选得到的一株海洋假单胞菌 (Pseudomonadaceae oryz化abitans)皿P022,保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。 本发明用生物信息学分析的方法，从基因组测序的假单胞菌（Pseudomonadaceae oryz化abitans)皿P022中筛选得到醋酶基因 P肥21，全长为966bp(从起始密码子到终止密 码子），编码321个氨基酸。通过克隆编码醋酶P肥21的醋酶基因 P皿21并将其连接表达载体 祀T-28a( + )后转化大肠杆菌化2UDE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的醋酶P肥21。 醋酶P皿21可用于制备（5)-3-?基下酸乙醋，利用重组表达的醋酶P皿21作为催化剂，制备 得到了光学纯度大于99%的（5)-3-?基下酸乙醋。醋酶P皿21在生物化工和生物医药等领 域具有非常大的应用价值。
【附图说明】
[001引图1是不同侧链长度的对硝基苯酪醋对醋酶P肥21酶活的影响。
[0019] 图2是醋酶PHE21的最适抑及抑稳定性。其中，A为最适抑曲线图，B为抑稳定性曲线 图。
[0020] 图3是醋酶P肥21的最适反应溫度和溫度稳定性。其中，A为最适反应溫度曲线图，B 为溫度稳定性曲线图。
[0021 ] 图4是不同浓度NaCl对醋酶P肥21酶活性影响。
[0022] 图5是醋酶P皿21拆分（± )-3-径基下酸乙醋反应GC图。A为样品（± )-3-径基下酸 乙醋气相图，B为醋酶PHE21拆分（± )-3-径基下酸乙醋反应1.化后的气相图，其中S代表 (5)-3-?基下酸乙醋，R代表(10-3-?基下酸乙醋。
[0023] 图6是醋酶P肥21的蛋白表达纯化情况。其中，Μ为蛋白Marker，1为未经IPTG诱导的 含有祀T-28a( + )-P肥21的大肠杆菌BL21(DE3)，2为经IPTG诱导的含有祀T-28a( + )-P肥21的 大肠杆菌化21(DE3)，3为儀柱穿透液，4为Μ柱纯化后得到的醋酶P肥21，5为经过脱盐柱后 的醋酶P肥21。
【具体实施方式】
[0024] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0025] 下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生 产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径 得到。
[0026] 本发明的醋酶基因 PHE21来自深海样品中筛选得到的一株海洋假单胞菌 (Pseudomonadaceae oryz;Lhabitans)HUP022,该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验 室。
[0027] 实施例1:醋酶基因 P肥21引物设计及开放阅读框边界确定
[0028] 提取假单胞菌（Pseudomonadaceae oryz;Lhabitans)册P022的基因组DNA，经测序 验证无误后，利用生物信息学手段对基因组进行注释，分析其中的醋酶基因，确定了其中醋 酶基因 P肥21的开放阅读框，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，全长为966bp(从起始密码 子到终止密码子），其编码的醋酶P肥21的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共321个氨基酸。 根据分析得到的醋酶基因 P Η E 2 1序列，设计引物如下：正向引物：5 / - CACGAATTCATGCCCGACGTCTTCGCGCG-3^，下划线部分为EcoRI酶切位点；反向引物：5'- CCGCTCGAGTTAGGCGGCCTGCTGCAGATGC-3^，下划线部分为化〇 I酶切位点。
[0029] 实施例2:醋酶基因 P肥21的克隆及载体构建
[0030] 2.1PCR 扩增
[0031 ] 将实施例1设计的引物(正向引物:5^ -CACGAATTCATGCCCGACGTCTTCGCGCG-3^，反向 引物：5^ -CCGCTCGAGTTAGGCGGCCTGCTGCAGATGC-3^ )送至上海生物工程有限公司合成引物， 合成的引物使用TE稀释到ΙΟμΜ，提取假单胞菌(Pseudomonadaceae oryzihabitans)HUP022 的总DM作为DM模板，建立如表1所示反应体系：
[0032] 表1PCR反应体系
[0033]
[0034] 使用W下PCR扩增程序扩增醋酶基因 P皿21: a. 94°C变性3min; b. 94°C变性30s，55 ~65°C退火0.5min，72°C延伸Imin，进行30个循环；c. 72°C延伸lOmin，冷却到10°C。
[003引将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观 察。回收966bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20化无菌水洗 脱，得到纯化回收的PCR产物。
[0036] 2.2 酶切
[0037] 将纯化回收的PCR产物使用W下体系进行双酶切，酶切时间化。酶切体系为:EcoRI 2化，XhoI2化，DNA<0.3yg，灭菌的双蒸水加至30化。酶切后纯化回收得到经过双酶切的PCR 产物。
[0038] 质粒祀T-28a( + )的双酶切:挑取含有质粒祀T-28a( + )的大肠杆菌D册α单菌落，过 夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用EcoR巧肋hoi按W下体系双酶切，酶切时间Ih。酶 切体系为:EcoRI化L，趾〇1化L，质粒DNA<lyg，灭菌的双蒸水加至20化。酶切后纯化回收得 到经过双酶切的祀T-28a (+)载体。
[0039] 上述双酶切使用的限制性内切酶为化ermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化 回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen，Hipure Gel化re DNA Micro Kit),质粒提取试剂 盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。
[0040] 2.3 连接
[0041 ]将经过双酶切的PCR产物和祀T-28a( + )载体按照3:1的摩尔比例进行连接。连接使 用的T4连接酶购自北京全式金生物技术有限公司，连接使用的酶量为抓/5化连接体系，连 接溫度为25°C，连接时间30min。由此得到连接产物。
[004引2.4转化及筛选
[0043] 取扣L连接产物于50化大肠杆菌D册a感受态细胞中，冰浴30min，后于42°C水浴锅 热激90s，冰浴2min后加入50化L LB液体培养基，37°C20化pm转速下，解育培养化。取一定量 的菌液涂布于含10化L/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mL LB培养 基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。
[0044] 2.5基因核巧酸序列测定
[004引将筛选的正确阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与醋 酶基因 P肥21核巧酸序列进行比对，确认是将醋酶基因 P皿21(其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1 所示)插入到祀T-28a( + )质粒中，结果完全