一种稳定性提高的胆盐水解酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种稳定性提高的胆盐水解酶突变体，属于酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 胆汁是哺乳动物对摄入的脂肪进行初级消化的物质，其主要成分胆汁酸（bile acids)在体内W钢盐或钟盐的形式存在，简称胆盐(bile salts)。胆盐由盐初级胆汁酸和 次级胆汁酸盐组成。初级胆汁酸盐，由肝细胞合成，包括胆酸、碟脱氧胆酸及其与甘氨酸和 牛横酸结合的产物;次级胆汁酸盐，是初级胆汁酸盐在肠道中受细菌作用生成的脱氧胆酸 和石胆酸及其在肝中生成的结合产物。由于胆汁酸作为一种信号物质，在生物循环中，参与 了机体脂质、胆固醇和糖的生化代谢及调节，因此，研究人员认为改变胆汁酸的组成和流量 可W作为一种治疗代谢综合征的新方向。
[0003] 胆盐水解酶(B細)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，是 降解胆汁的主要组成成份一一共辆胆酸第一步所需的酶。胆酸盐水解酶可将共辆胆酸水解 成牛横酸或甘氨酸和游离胆酸，后者可由其它肠道微生物在肠道内作进一步降解。胆酸盐 水解酶的生理作用体现在两个方面:一、影响宿主的脂肪代谢过程，减少脂肪的消化吸收和 降低胆固醇水平等;二、胆汁的降解减少了胆汁对肠道微生物的毒性，改善了微生物生存的 肠道环境；由降解产生的氨基酸和游离脂肪酸还可为微生物提供营养物质。
[0004] 运用基因工程手段提高胆盐水解酶的稳定性将为研究B甜作用于宿主和菌体提供 技术平台，对运用BSH调节宿主健康状况，改善微生物在复杂肠道环境的生存具有重要意 义。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述问题，本发明提供了一种稳定性提高的胆盐水解酶突变体，所述突 变是对氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的来源于唾液乳酸杆菌的胆盐水解酶BSH2内部氨基 酸进行定点突变，从而提高了胆盐水解酶的稳定性。
[0006] 所述突变是将胆盐水解酶第58位的谷氨酷胺突变为丙氨酸，得到突变体Q58A。
[0007] 所述胆盐水解酶突变体Q58A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[000引在本发明的一种实施方式中，所述突变体的核巧酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0009] 本发明的第二个目的是提供编码所述胆盐水解酶突变体的核巧酸片段、含有所述 胆盐水解酶突变体的载体，W及表达所述胆盐水解酶突变体的的基因工程菌。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为大肠杆菌，是将含有编码所述胆 盐水解酶突变体的基因与表达载体连接后转化大肠杆菌。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是祀T-20b( + )为载体、E.coli BL21 (DE3)为宿主表达所述突变体。
[0012] 本发明的第Ξ个目的是提供一种生产胆盐水解酶的方法，是利用编码所述胆盐水 解酶突变体的核巧酸片段、含有所述胆盐水解酶突变体的载体或者表达所述胆盐水解酶突 变体的基因工程菌。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是将表达所述胆盐水解酶突变体的基因工 程菌诱导培养后收集菌体，并破壁纯化获得;所述破壁纯化是收集菌体后，用0 . lM、pH 6.0 的憐酸盐缓冲液洗涂离屯、2次，并重悬，超声破碎5min，离屯、收集上清液，经过儀柱亲和柱层 析和截留分子量为lOkDa的超滤膜进行纯化浓缩，获得单一重组蛋白。
[0014] 所述诱导培养，是培养种子液，按接种量为1 %接种到TB液体培养基中，37°C培养； 菌体长到ODsqq为0.別寸，加入IPTG诱导，并将培养溫度降到20°C，培养2地。
[0015] 本发明还要求保护所述胆盐水解酶突变体，或者利用生产胆盐水解酶的方法生产 得到的胆盐水解酶在食品、农业或制备药物方面的应用，尤其是在制备微生态制剂、药物表 达载体或饲料添加剂方面的应用。
[0016] 本发明的第四个目的是提供一种提高胆盐水解酶BSH2稳定性的方法，是将氨基酸 序列如SEQ ID NO. 1所示的胆盐水解酶蛋白质分子内部第58位的谷氨酷胺突变为丙氨酸。
[0017] 关于突变体命名：
[0018] 亲本氨基酸位点取代后氨基酸"表示突变体，比如S32A，是指在亲本氨基酸序 列的基础上将第32位的氨基酸S(丝氨酸，Ser)突变为氨基酸A(丙氨酸，Ala)。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 本发明通过定点突变的方式，将胆盐水解酶分子内部疏水腔入口处的氨基酸谷氨 酷胺突变成丙氨酸，改变了分子表面疏水性，将胆盐水解酶热稳定性增加了 20°C，氧化稳定 性提高了3倍。本发明的基因工程菌生产的胆盐水解酶变异体蛋白，稳定性提高，为工业应 用奠定了基础。
【附图说明】
[0021] 图1:胆盐水解酶野生型BS肥与突变株Q58A的热稳定性的比较；
[0022] 图2:胆盐水解酶野生型BS肥与突变株Q58A的氧化稳定性的比较。
【具体实施方式】
[0023] LB培养基:膜蛋白腺lOg/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0;
[0024] TB培养基：蛋白腺 12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmo 1/L Κ出P〇4，72mmo 1/L K 抽 K)4。
[0025] 胆盐水解酶活性鉴定方法:滴加扣L受体菌菌液至别含有0.01%猪胆盐(w/v)的LB 固体平板(含10化g/mL氨节青霉素和24yg/血IPTG)上，通过能否产生白色或透明沉淀圈检 验胆盐水解酶的活性。
[00%]胆盐水解酶酶活测定方法:取10化酶液用0.1M憐酸盐缓冲液(pH 6.0)稀释至90μ L，加入10化结合胆盐(200mM)混合，于37°C解育30min，加入等体积的15 % (w/v)S氯乙酸终 止反应，离屯、后取10化上清液与19化L巧Ξ酬试剂混合，于100°C反应15min，冷却后于570皿 处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，巧Ξ酬试剂的组成为:0.5mL l%(w/ V)巧Ξ酬(溶解于0.5M、p册.5巧樣酸盐缓冲液），1.2mL甘油，0.2血0.5M、p册.5的巧樣酸缓 冲液。
[0027] 实施例1:重组菌的构建
[00%] w前期构建的携有胆盐水解酶BSH2