拟茎点霉gpdh基因扩增引物及其设计方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设计拟茎点霉真菌鉴别技术领域，具体的说，设及拟茎点霉GPDH基因扩增 引物及其设计方法和应用。
【背景技术】
[0002] 拟茎点霉属(Phomopsis(Sacc.化ubak)真菌是重要的植物病原菌和植物内生菌， 其有性态为间座壳属(Diapodhe)，主要集中在热带和亚热带地区。拟茎点霉属真菌是农业 和林业上重要的病原菌，寄主植物多达74科，可引起多种植物病害，例如溃瘍、果腐、叶枯、 枝枯、根腐、树皮坏死等。此外，该属的部分种类还是植物的重要内生菌和腐生菌，在自然生 态系统中占有非常重要的地位。
[0003] 传统形态学方法一直是真菌分类鉴定的基础，但由于拟茎点霉表型特征具有较高 的相似性，因而难W精准鉴定。早期对拟茎点霉种级分类研究主要W寄主植物属为基础，但 拟茎点霉部分种类没有寄主专化性，他们可W同时侵染几个属甚至不同科的植物，因此W 寄主作为该属真菌的分类依据并不准确。
[0004] 3-憐酸甘油脱氨酶（glyceraldehyde-3-地OS地ate dehy化ogenase，GPDH)是甘油 产生途径的关键酶，参与糖酵解过程中第一个ATP的形成，使3-憐酸甘油醒转变为1，3-二 憐酸甘油醒。同时，GPDH基因还具有抵抗逆境胁迫的功能，当活细胞处在各种环境压力的 条件下，例如高溫、高盐、低溫等胁迫，其基因表达模式将发生改变。由于GPDH属于组成型表 达，且易于扩增，故广泛用作内参基因使用。研究表明真菌GPDH基因包含十分丰富的信息位 点，拥有更高的种间变异率及更小的种内变异率，可用于构建系统发育树、物种分类鉴定、 种群进化等研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一对高效的拟茎点霉GPDH基因扩增引物。
[0006] 本发明的另一个目的是提供上述引物的设计方法。
[0007] 本发明的进一步目的是提供上述引物在拟茎点霉种类鉴定、地理种群鉴别和检验 检疫中的应用。
[000引本发明设计的拟茎点霉GPDH基因扩增引物，其上游引物PGP-f有47个碱基： CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCCGTCAACGACCCCTTCATTGA，下游引物PGP-r有48个碱基： AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGTo
[0009] 本发明的拟茎点霉GPDH基因扩增引物设计的步骤为:登陆GenBank捜索目前已测 定全序列的60种拟茎点霉GPDH基因，去掉不完全和部分的序列，寻找保守序列，并在5 '端加 入测序序列，从而获得一对通用引物：其上游引物P G P - f有4 7个碱基： CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCCGTCAACGACCCCTTCATTGA，下游引物PGP-r有48个碱基： AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT。扩增片断大小在 230bp 左右。
[0010] 可扩增拟茎点霉属真菌GPDH基因的通用引物PCR反应体系和反应条件如下： (l)PCR反应体系：共25化，内含2X Taq MasterMix 12.扣L、10yM的引物PGP-f和引 物PGP-r各化L、含50~15化g的DNA模板溶液化L、d地20 9.5化。（2)扩增条件:94°(3预变 性3min，然后94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，共35个循环，最后在72°C充分延伸 lOmin。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。
[001。 本发明所述的拟茎点霉GPDH基因增引物可扩增拟茎点霉GPDH基因片段，能获得单 一的目的片段，产物大小为230bp左右，并可对PCR扩增产物进行直接测序。其步骤为:PCR 扩增产物经初步定量后，浓度达lOOng/化的样品委托公司进行双向直接测序，测序引物为 Μ13Ρ-47(10μΜ)和Κν-Μ(ΙΟμΜ)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。
[0012]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:本发明的拟茎点霉GPDH基因扩增引 物对我国常见拟茎点霉真菌GPDH基因进行扩增，均能获得单一的目的DNA片断，特异性扩增 产物大小为23化P左右，经测序及与GenBank上同源序列的比较，证实为拟茎点霉GPDH基因 的扩增产物。GPDH基因信息位点丰富，种间变异率较高，利用本发明设计的引物与ITS引物 联合使用，可W准确鉴定某些难于鉴别的近缘物种，为口岸检疫工作提供了重要的工具。
【附图说明】
[0013 ] 图1、图2均为PGP-f/PGP-r扩增不同拟茎点霉GPDH基因的电泳图谱。
[0014] 其中M:DNA分子量标准（2000bp DNA Ladder)，N:阴性对照，1-32:依次为扁桃拟 茎点霉（Phomopsis amygdaliana)、梨干枯拟茎点霉（Phomopsis fukushii)、大豆拟茎点种 腐病菌（Phomopsis longicolla)、苹果拟茎点菌（Phomopsis mali)、芒果拟茎点霉 (Phomopsis man邑iferae)、叶下珠生拟茎点霉(Phomopsis phyllanthicola)、柿苗拟茎点 霉（Phomopsis rojana)、茶溃瘍拟茎点霉（Phomopsis theae)、茎生拟茎点霉（Phomopsis trunci col a)、石恼干腐菌（Phomopsis verson i ana)、葡萄生拟茎点霉菌（Phomopsis viticola)、芦算拟茎点霉(Phomopsis aspara邑i)、糕竹拟茎点霉(Phomopsis rhapidis)、 茄褐纹拟茎点霉（Phomopsis vexans)、精拟茎点霉（Phomopsis cinnamom)、蔓绿绒拟茎点 霉（Phomopsis philoden化i)、花烛拟茎点霉（Phomopsis anthurii)、黄瓜黑色根腐病菌 (Phomopsis sclerotioides)、栗拟茎点霉（Phomopsis castanea)、柿拟茎点霉（Phomopsis diospyr)、茵香拟茎点霉（Phomopsis foeniculi)、十字花拟茎点霉（Phomopsis cruciferae)、杏拟茎点霉（Phomopsis amy 邑 da 1 i )、荷麻拟茎点霉(Phomopsis abutilonis)、仙人掌拟茎点霉（Phomopsis cacti)、橡胶拟茎点霉（陆omopsis heveae)、小 麦拟茎点霉（Phomopsis conhoversa)、越橘果腐病（Phomopsis.vaccinii)、石恼干腐菌 (化omopsis .versoniana)、石恼干腐菌（Phomopsis . versoniana)、木犀拟茎点霉 (化omopsis . osmanthi )、木兰生拟茎点霉（Phomopsis .magnol i icola)、柳拟茎点霉 (Phomopsis.salicina)。
【具体实施方式】
[0015] 登陆GenBank捜索目前已测定全序列的60种拟茎点霉GP畑基因，去掉不完全和部 分的序列，寻找保守序列，并在5'端加入测序序列，从而获得一对通用引物：其上游引物 PGP-f 有 47 个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCCGTCAACGACCCCTTCATTGA，下游引物PGP-r 有 48 个碱基:AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT。
[0016] 可扩增拟茎点霉属真菌GPDH基因的通用引物PCR反应体系和反应条件如下： PCR反应体系为2^iL，内含2X Taq MasterMix、10yM的引物PGP-r和引物PGP-r、含50 ~15化g的DM模板溶液、d地20。
[0017] 2X Taq MasterMix 12.扣L、PGP-f lliL'PCP-r lliUTemplate 1化、(1 地20 9.5μ L，扩增条件为:94°C预变性3min，然后94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，共35个循 环，最后在72°C充分延伸lOmin。扩增产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮 度。
[001引本发明所述的拟茎点霉GP畑基因增引物能扩增拟茎点霉属真菌GPDH基因，均能获 得单一的目的DNA片段，产物大小为23化P左右，并对所有PCR扩增产物进行直接测序。其步 骤为:PCR扩增产物经初步定量后，浓度达l(K)ngAil的样品委托公司进行双向直接测序， 测序引物为Μ13Ρ-47(10μΜ)和Κν-Μ(ΙΟμΜ)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。 [0019]本发明的拟茎点霉GPDH基因扩增引物对我国常见拟茎点霉真菌GPDH基因进行扩 增，均能获得单一的目的DNA片断，特异性扩增产物大小为230bp左右，经测序及与GenBank 上同源序列的比较，证实为拟茎点霉GPDH基因的扩增产物。其主要扩增的拟茎点霉真菌包 括W下种类：扁桃拟茎点霉（Phomopsis amygdaliana)、梨干枯拟茎点霉（Phomopsis fukushii )、大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsis longicolla)、苹果拟茎点菌（Phomopsis mali)、芒果拟茎点霉（Phomopsis mangiferae)、叶下珠生拟茎点霉（Phomopsis phyllanthicola)、柿苗拟茎点霉（Phomopsis rojana)、茶溃瘍拟茎点霉（Phomopsis theae)、茎生拟茎点霉（陆omopsis huncicola)、石恼干腐菌（Phomopsis versoniana)、葡 萄生拟茎点霉菌（Phomopsis viti CO la)、芦算拟茎点霉（Phomopsis asparagi)、糕竹拟茎 点霉（Phomopsis rhapidis)、茄褐纹拟茎点霉（Phomopsis vexans)、精拟茎点霉 (Phomopsis cinnamom)、蔓绿绒拟茎点霉（Phomopsis philodendri)、花烛拟茎点霉 (Phomopsis anthurii)、黄瓜黑色根腐病菌（Phomopsis sclerotioides)、栗拟茎点霉 (Phomopsis castanea)、柿拟茎点霉（Phomopsis diospyr)、茵香拟茎点霉（Phomopsis foeniculi)、十字花拟茎点霉（Phomops i s cruciferae)、杏拟茎点霉（Phomops i s amygdali )、荷麻拟茎点霉（Phomopsis abutilonis)、仙人掌拟茎点霉（Phomopsis cacti)、橡胶拟茎点霉（Phomopsis heveae)、小麦拟茎点霉（Phomopsis conhoversa)、越 橘果腐病（Phomopsis . vaccini i)、石恼干腐菌（Phomopsis . versoniana)、石恼干腐菌 (化omopsis . versoniana)、木犀拟茎点霉（Phomopsis . osmanthi)、木兰生拟茎点霉 (Phomopsis .ma即oliicola)、柳拟茎点霉（Phomopsis . salicina)。其电泳图谱如图 1、图2 所示，从而可对拟茎点霉真菌进行分析鉴别。
【主权项】
1. 拟茎点霉GPDH基因扩增引物，其特征是将测序序列和扩增序列结合在一起，其上游 引物 PGP-f有47个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCCGTCAACGACCCCTTCATTGA，下游引物 PGP-r 有 48 个碱基:AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT。2. 权利要求1所述扩增引物的设计方法，其特征包括如下步骤:找出已测定全序列的60 种拟茎点霉GPDH基因，去掉不完全和部分序列，进行同源性比较，寻找保守序列，并在5'端 加入测序序列，从而获得一对通用引物。3. 权利要求1中所述拟茎点霉GPDH基因扩增引物在物种鉴定、地理种群分析以及口岸 检验检疫中的应用。
【专利摘要】本发明公开了拟茎点霉GPDH基因扩增引物及其设计方法和应用。本发明设计的是针对拟茎点霉属真菌的通用引物。其上游引物PGP-f有47个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCCGTCAACGACCCCTTCATTGA，下游引物PGP-r有48个碱基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT。本发明设计的GPDH引物对拟茎点霉属通用性强，扩增片段包含丰富的信息位点，拥有更高的种间变异率及更小的种内变异率，可用于构建系统发育树、物种分类鉴定、种群进化等研究，为拟茎点霉检疫鉴定工作提供了重要工具。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105543217
【申请号】CN201510897105
【发明人】胡佳续, 郭京泽, 刘鹏, 张瑞峰, 廖芳, 林宇, 黄国明, 牛春敬
【申请人】天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月8日