一种肌肉生长抑制mstn基因及其在云南土鸡选育中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及动物分子育种的基因工程技术，特别是一种与鸡肉生成相关的肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)基因及其在云南土鸡选育中的应用。
【背景技术】
[0002]近年来，消费者倾向于购买腹脂含量低、肌肉脂肪含量较低，但不饱和脂肪酸含量较高并且口感细嫩、鲜美多汁的鸡肉，为了满足人们的消费需求，商家过于追求高瘦肉率的肉品，导致鸡肉品质的严重下降。为了获取胴体率很高的家禽，发现了肌肉组织中存在的肌肉生长抑制素(my0statin，MSTN)。研究发现MSTN基因作用机理大致如下:当成肌细胞同MSTN基因共同产生时，成肌细胞的增殖随MSTN基因水平的升高而降低。MSTN基因抑制C2C12成肌细胞从细胞周期的Gl到S阶段的过渡JSTN基因特异性地正向调控P21 (—依赖于细胞周期蛋白的激酶抑制因子)，同时降低成肌细胞中cdk2蛋白的浓度和活性，此时Rb主要以低磷酸化的形式存在，磷酸化的Rb与转译因子如E2F-DPI的结合，从而使细胞分化在Gl期停止。这些结果表明，P21表达量升高，cdk2蛋白降低，导致低磷酸化Rb蛋白的集中。这样，将细胞周期阻止在Gl期，另外，过量表达的MSTN基因还减少GO-Gl转化的次数，所以抑制MSTN基因的活性能加快细胞循环，促进成肌细胞的分裂。因此可以推测，动物的肌肉增生现象，是缺乏活性MSTN基因，逆向调控成肌细胞增殖的结果。体外研究结果表明，重组MSTN基因抑制C2C12成肌细胞及160日龄牛胚胎成肌细胞的分，且MSTN基因抑制效应是可逆的，当除去MSTN基因时，成肌细胞恢复正常分裂和正常生长的能力。MSTN基因的发现对阐明骨骼肌生长发育的调控机理具有重要的意义，同时将为畜牧业改良动物的肉品质开辟一条新途径。
[0003]MSTN基因在猪、人、绵羊和牛中已被定位和标记。在畜禽育种过程中，对畜禽生长速度过度选择导致骨骼肌过快发育，脂肪含量过高，降低了饲料转化率。因此，MSTN基因的研究对控制畜禽肌肉增长，改善肌肉品质具有重要的意义。目前MSTN基因的表达对鸡的肌肉生成的影响及调节机理，国内外尚未报道。
【发明内容】
[0004]鉴于以上研究背景，本发明提供一种肌肉生长抑制MSTN基因及其在云南土鸡选育中的应用，采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对武定鸡和微型鸡肌肉组织的基因表达谱研究中发现MSTN基因参与抑制肌肉生成过程，通过对云南本土的微型鸡、武定鸡的MSTN基因进行测序，首次从鸡的肌肉组织中克隆了MSTN基因，使用分子生物学手段研究MSTN基因的表达量与生长性能、屠宰性能的调控规律，探讨微型鸡、武定鸡生长发育的的规律，对于云南本土鸡种的保种、开发利用，尤其是来加快其生产性能提供理论参考。
[0005]本发明的目的是提供一种肌肉生长抑制MSTN基因，是从武定鸡鸡肌肉组织中分离、克隆的与肌肉生成相关的肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)基因，武定鸡的MSTN基因由3个外显子和2个内含子组成，夕卜显子1、2、3分别为373bp、374bp和1567bp，2个内含子分别为2094bp和2269bp，其序列如SEQ.1D.N0.1，通过对云南本土的武定鸡的MSTN基因进行测序，首次从鸡的肌肉组织中克隆了MSTN基因。
[0006]本发明的另一个目的是肌肉生长抑制MSTN基因在云南地方鸡作为肌肉生长抑制特性的分子遗传标记的应用，对肌肉生长抑制素MSTN基因设计引物，进行PCR扩增，通过检测MSTN基因在鸡肌肉组织的组织表达谱，来对云南地方鸡种的肌肉生长抑制特性进行判断，其具体步骤为:
[0007]步骤一、肌肉组织中总RNA的提取
[0008]前处理:提取RNA之前，先消除器皿及溶液中可能存在的RNA酶。所用的塑料器皿的消毒:一次性塑料器皿，在灭菌锅内高压处理15?20min。非一次性塑料器皿，先用清洁剂洗干净，再用0.1M NaOHamM EDTA第一次冲冼，无RNA酶水第二次冲冼;镊子、剪刀及以后要用的玻璃器皿的消毒:将镊子、剪刀及玻璃器皿置于中180°C烘烤5h以上；电泳槽的消毒:先用清洁液洗干净，在0.1 %的DEPC水中浸泡过夜后干燥。
[0009]提取:取60-100mg冷冻保存的脂肪或肌肉组织于研磨器内，加入Iml的Trizol试剂中低温条件下进行匀浆。匀浆后的混合液转移到1.5ml的离心管中，在2?8°C温度条件下12000rpm离心lOmin，使核蛋白质复合体充分分离。然后将上清液移入一个干净的离心管中。加入0.2ml的氯仿后，压紧管盖剧烈振荡15sec，常温静置3?5min后，2?8°CI100rpm再离心15min。可见液体分三层。将上层清液移入1.5ml的离心管，加入0.5ml的异丙醇混勾后，常温静置孵育lOmin，在2?8°C11000Xg离心lOmin，沉淀RNA。倒掉上清液，最后用75%的酒精7500rpm离心5min以洗涤RNA沉淀，并重复该步骤一次。倒掉上清液后，将离心管于室温凉干15?30min，干燥RNA沉淀，加入30-50μ1无RNase的DEPC处理水，使RNA溶解完全，并立即保存于-80°C超低温冰箱中待用。
[0010]步骤二、CDNA第一链的合成(RT-PCR)
[0011]采用北京天根生物工程技术服务有限公司提供的试剂盒进行反转录合成cDNA。其步骤为:在已灭菌无核酸酶的的PCR管中加入1.5yg的总RNA，加入浓度为0.5ygAU Oligo(dT)182yl随机引物和2μ1 dNTP，补无菌水(RNase-free ddH20)至14μ1。轻轻混匀离心3?5sec后，将反应混合物于70°C加热5min后迅速在冰上冷却2min后，简短离心5_8sec收集反应液加入4μ1 5 XFirst-Strand Buffer、Ιμ? 0.1M DTT。最后加入Ιμ?(200U)TIANScriptM-MLV，使混合液的终体积为20μ1，混匀；将总反应体系置于PCR仪中，42°C孵育50min，90°C加热5min终止反应，结束后或置冰上进行后续实验或冷冻保存。
[0012]步骤三、PCR引物设计及PCR反应条件
[0013]参照GenBank(http://www.ncbi.nIm.nih.gov)公开发表的MSTN基因全长序列和禽18s核苷酸序列运用Pr imer5.0软件进行引物设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。MSTN基因和18S的产物长度分别为176bp和148bp，引物序列如下:
[0014]MSTN基因引物序列:
[0015]上游:5’GCTTTT GAT GAG ACT GGA CGA G_3’
[0016]下游:5’AGCGGG TAG CGA CAA CAT C_3’
[0017]18S基因的引物序列:
[0018]上游:5，-CGCGTG CAT TTA TCA GAC CA-3，
[0019]下游:5’-ACCCGT GGT CAC CAT GGT A_3’
[0020]MSTN基因克隆的PCR反应条件为:在PCR管内依次加入cDNA模板1.Ομ?，10 X反应缓冲液(buffer)2.0yl，Mg2+0.5yl dNTPs( 10mM)0.5μ1，正、反引物混合(1mM ) I.Ομ?，Taq酶
0.5μ1，补去离子水至25μ1的反应总体积，置于PCR仪上，95°C预变性1min，94°C变性45sec，Tm(54°C-64°C, Grad = 10)退火 45sec，7 2°C 延伸 lmin，共 35 个循环，最后 72°C 再延伸 8min，反应结束后，用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果，用DNA marker来判断扩增片段的大小，用以确定MSTN基因的退火温度即最佳反应条件。
[0021]经最佳反应条件扩增的PCR产物，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，如产物在凝胶成像系统中目的带明亮清晰，则可用于胶回收及后续实验。
[0022]荧光定量PCR的反应条件为:在80°C检测荧光，测定吸光值，得到以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的荧光定量PCR扩增动力学曲线和以标准品拷贝数的对数值