一种来源于铜绿假单胞菌的抗hppd抑制剂基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物基因工程领域和植物遗传工程学领域，具体涉及一种来源于铜绿假单胞菌的抗HPro抑制剂基因及其在转基因植株中的应用。
【背景技术】
[0002]对羟苯基丙酮酸双氧化酶(4一HPPD，ECl.13.11.27)是大部分生物体内催化酪氨酸代谢的重要的酶 lknder D A.Amino Acid Metabolism(2nd ed) [M].Lon一don: JohnWiley & Sons，1985: 208—221.它可催化酪氨酸降解产物对羟苯基丙酮酸转化为尿黑酸，尿黑酸是植物体内一种重要物质，它可以进一步脱酸、聚戊二烯基化和烷基化，从而生成光合作用中电子传递所需要的质体醌和生育酸(Crouch N.P.等人1997,Tetrahedron,53,20,6993-7010,Fritze等人，2004,Plant Phys1logy 134:1388-1400)自从HPPD酶在20世纪30年代被发现以来，已不断从鼠、鸡、猪、狗及人类的肝脏中以及假单细胞菌、玉米、胡萝卜、小麦等体内提取出来Barta 1.C.&P.B oger，Purificat1n and Characterizat1n of4-HydroxyphenyIpyruvate D1xygenase from Maixe,Pestic.Sc1., 1996， 48: 109-116.[5]0
[0003]已经证明HPPD抑制剂作用于靶酶HPPD，可有效抑制对羟苯基丙酮酸转化为尿黑酸，从而导致质体醌和生育酚的合成受阻。质体醌和生育酚是光合作用中电子传递所需要的重要物质，因而HPro抑制剂同时起着光合作用电子传递抑制剂的角色。此外，质体醌还是八氢番茄红素去饱和酶的关键辅助因素，质体醌的减少使八氢番茄红素去饱和酶的催化作用受阻，从而影响类胡萝卜素的生物合成。类胡萝卜素既可作为光吸收体，又可作为保护性物质，降低三线态叶绿体或单线态氧的激发，类胡萝卜素的生物合成被抑制将导致植物最终死亡。这样HPro抑制剂同时又起着八氢番茄红素去饱和酶抑制剂的角色，是一类很有前途的除草剂。
[0004]早在1985年就有报道指出，HPH)可能是开发除草剂新品种的新靶标；1992年发现，三酮类化合物是HPro的潜在抑制剂;到目前为止，除了 80年代开发的吡唑类品种外，新近又开发出若干广谱高活性新品种，即三酮类的磺草酮与甲基磺草酮以及异恶唑类的百农思。这表明，HPro作为靶标，涉及的化合物类型不断增多，成为今后开发除草剂新品种的重要领域之一。目前，已经商业化的HPro抑制性除草剂主要属于四个化学家族:三酮类(例如磺草酮、甲基磺草酮)、二酮腈类、异噁唑类(例如异噁氟草)、吡唑类(例如吡唑特、吡草酮和苄草唑)
目前，HPPD抑制剂型除草剂被广泛应用到对其具有代谢耐受性的植物中(例如玉米可迅速代谢掉HPPD抑制剂)，用以防治杂草。为了能扩大HPPD抑制剂型除草剂的应用范围，迫切需要对植物(特别是没有代谢耐受性的植物)进行改造，以赋予其对HPPD抑制剂的耐受性。
[0005]已有很多报道通过向植物中转入外源的HPH)抑制剂抗性基因以赋予植物对HPPD抑制剂的耐受性，例如，Dufourmantel等人将假单胞菌属的HPPD抑制剂抗性基因转入烟草和大豆中，获得了对异恶卩坐草酮的耐受性(DuDufourmanteI等人，2007,Plant B1technolJ.5(l):118-33)o
[0006]在W099/24585中，公开了一个突变的ΗΡΗ)核苷酸序列及其获得对某些ΗΡΗ)抑制剂具有耐受性的植物。
[0007]为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的HPro抑制剂抗性基因和以此为基础的抗HPro抑制剂转基因植物。
[0008]本发明所提供的新的HPPD抑制剂抗性基因，是发明人用PCR的方法从发明人筛选的高HPro抑制剂抗性菌株中克隆得到。本发明进一步在拟南芥、水稻、玉米等植物中证明了这个HPH)抑制剂抗性基因的抗HPH)抑制剂能力及其在发展转基因抗HPPD抑制剂农作物中的用途。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题在于提供新的使植物具有HPPD抑制剂抗性的基因及其编码蛋白。另外，本发明还提供了这个基因的基因工程中间体(如表达盒、载体和细胞等)，获得具有HPPD抑制剂抗性的植物的方法和应用，并提供了判断植物是否具有HPro抑制剂抗性的鉴定方法。具体而言，在第一方面，本发明提供了一种对HPro抑制剂具有高抗性的新基因，本发明所提供的HPro抑制剂抗性基因，是发明人筛选并克隆到的一种新的抗HPPD抑制剂基因(以下称为Pa-HPPD基因)O Pa-HPro基因是用PCR方法从发明人筛选的高HPTO抑制剂抗性菌株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中克隆得到的。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)H_l为本发明人从喷洒HPF1D抑制剂的试验田土壤中经初筛和复筛等大量的实验得到的对HPH)抑制剂具有高耐受活性的菌株。菌株H-1于2015年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.11897，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。Pa-HPH)基因是下述核苷酸序列之一:
1)序列表中SEQID NO:1所示的核苷酸序列；
2)与SEQID N0:1序列具有90%以上相似性且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
3)与SEQID NO:1相比，具有SEQ ID NO:1序列的部分、区段和/或片段(包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端缺失)、其变体、突变体、嵌合体和融合物且可编码赋予HPH)抑制剂抗性活性的蛋白质的核苷酸序列；
4)根据SEQID NO:1，利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码高HPH)抑制剂抗性活性的蛋白质多肽；
5)通过导入SEQID NO:1所示的核苷酸序列的其他变异但是仍然编码具有抗HPH)抑制剂能力的蛋白质的核苷酸序列。
[0010]本发明第一方面的HPro抑制剂抗性基因的核苷酸序列可以有多种不同的变异，包括但不限于:I)利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码相同活性的蛋白质多肽;2)通过导入核苷酸序列的其他变异但是仍然编码具有抗HPPD抑制剂能力的蛋白质的核苷酸序列。这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的点变异，还可以是插入或者缺失的变异。本领域的一般技术人员就能够通过分子生物学的方法产生上述变异。[0011 ]在第二方面，本发明提供对HPro抑制剂具有高抗性的一种新的HPro抑制剂抗性基因的编码蛋白，由本发明第一方面的基因编码，该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:
1)由SEQID No:2代表的氨基酸序列组成的蛋白质，
2)与SEQID No:2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列组成且赋予高HPH)抑制剂抗性活性的蛋白质。
[0012](3)与SEQ ID No: 2代表的蛋白序列相比，有具有SEQ ID No:2序列的部分、区段和/或片段(包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端缺失)、其变体、突变体、嵌合体和融合物且赋予高HPro抑制剂抗性活性的蛋白。
[0013]在知晓具体序列的前提下，通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的