一种百合SuSy3基因的克隆及植物表达载体的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种百合SuSy3基因的克隆及用其构建的用于遗传转化的植物表达载体的构建方法，属于生物化学技术领域。
【背景技术】
[0002]兰州百合(Liliumdavidi i var.unico lor )系百合科(Li I iaceae)百合属(Lilium)川百合的一个变种。其鳞茎洁白硕大，味甘香甜，含有大量的碳水化合物、蛋白质及维生素等，具有很高的营养和药用保健价值，是食用百合中的名品，深受人们的欢迎;另外，兰州百合观赏价值极高，其花下垂，花被桔红色，向外翻卷，鲜艳夺目，是理想的盆栽、切花种类。
[0003]淀粉是百合鳞茎中碳水化合物的重要贮藏形式(Shinet al.，2002)，百合的整个生长发育过程是淀粉积累的过程(郑慧俊等，2006)，淀粉积累或分解与鳞茎发育进程有显著的相关关系(Xu et al., 2006)。在不同生长发育状态下，鳞茎内淀粉的合成和降解与蔗糖有着密切关系。已有的研究表明，百合鳞茎中淀粉的降解与蔗糖的增加是呈正相关的(Miller and Langhans, 1990;夏宜平等，2006)，并且鳞茎内糖分转运的主要形态是蔗糖(孙红梅，2005)。由于蔗糖只有在降解为己糖或磷酸己糖后才能作为淀粉合成的直接前体物质进入细胞代谢途径，因此，蔗糖的变化对于调节鳞茎的形成和发育至关重要，“蔗糖-淀粉”途径是导致鳞茎膨大的关键环节。
[0004]鹿糖可在鹿糖合成酶(Sucrose Synthase，SuSy，EC 2.4.1.13)调控下参与淀粉的合成，因而认识SuSy的生理作用、基因功能对于进一步弄清“蔗糖-淀粉”代谢机制以及百合鳞茎形成发育机理极为重要。SuSy基因表达研究表明，SuSy是豆类籽粒发育阶段库器官中蔗糖向淀粉转化的关键性酶，并且其活性与库强密切相关(Chopra J et al., 2000)。马铃薯、番茄和胡萝卜方面的研究显示，SuSy决定碳的分配和库强(谢虹等，2003)。在单子叶植物中，SuSy由两个不等位基因Susl和Sus2编码，在水稻中，甚至有第3个基因Sus3(Huang J Wet al., 1996)。大多数双子叶植物也由两个非等位基因编码SuSy，它们与单子叶植物的两类基因功能类似，但豆科植物根中只发现一种SuSy基因。SuSy基因在不同植物、不同发育期中各成员表达也各异，说明它们在植物生长发育中作用的复杂性。
[0005]因此，阐明百合SuSy基因调控蔗糖参与淀粉合成途径的作用具有重要意义，可为明确种球淀粉代谢机制奠定基础，并为生产优质百合种球、加快种球国产化进程提供实践依据。
【发明内容】
[0006]本发明的第一个目的在于为了解决目前可利用的球茎类植物蔗糖-淀粉代谢相关酶的基因比较少的问题，提供一个兰州百合鳞茎蔗糖代谢关键酶基因SuSy3，其蛋白由846个氨基酸组成，理论分子量为94.2 kDa，等电点为6.14，为序列表中的SEQ.1D.NO:2序列。
[0007]本发明的第二个目的在于提供编码百合SuSy3的基因序列，将此基因命名为LdSuSy3，基因全长2 805 bp，为序列表中的SEQ.1D.NO:1序列。
[0008]本发明的第三个目的在于提供一种百合SuSy3基因的植物表达载体的构建方法，构建了百合SuSy3基因的植物表达载体pMDC-SuSy3，为今后利用百合SuSy3基因进行百合种球品质改良提供理论及实验基础。
[0009 ]本发明基因的获得及植物表达载体的构建，使通过基因调控来控制蔗糖及淀粉代谢成为可能，对于培育高品质百合种质资源具有重要意义。
[0010]为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下:
[0011]本发明提供了一种百合SuSy3基因，序列如SEQ.1D.N0:1，编码的蛋白质如SEQ.1D.N0:2o
[0012]进一步地，上述百合SuSy3基因，是按如下步骤得到:(I)以多种植物的SuSy基因的保守功能区为模板，通过RT-PCR获得SuSy3基因的部分cDNA片段；(2)采用RACE技术，获得SuSy3基因的5 ’端和3，端cDNA片段；(3)通过对序列的拼接和分析，获得SuSy3基因的全长cDNA序列；(4)通过RT-PCR获得百合SuSy3基因的cDNA完整编码区片段。
[0013]本发明在利用上述百合SuSy3基因，构建一种用于遗传转化的植物表达载体，包括SuSy3基因的cDNA完整编码区片段。
[0014]进一步地，所述植物表达载体构建包括如下步骤:
(I)选取百合SuSy3基因的完整编码区片段，通过PCR技术在片段两端添加attB位点；
(2)通过Gateway技术的BP重组反应将步骤(I)得到的片段克隆至pDONRzeo载体上，获得入门载体；(3)通过Gateway技术的LR重组反应将步骤(2)得到的入门载体中的目的基因片段克隆至PMDC141上，获得最终表达载体pMDC-SuSy3。
【附图说明】
[0015]图1为本发明百合鳞茎总RNA:泳道M.Marker DL2000，泳道A和B.百合鳞茎总RNA ；
图2为本发明SuSy3-Pl片段电泳图:泳道M.Marker DL2000，泳道A.SuSy3_Pl片段；
图3为本发明SuSy3基因5’RACE片段SuSy3-P2电泳图:泳道M.Marker 01^2000，泳道八.SuSy3-P2 片段;
图4为本发明SuSy3基因3’RACE片段SuSy3-P3电泳图:泳道M.Marker 01^2000，泳道八.SuSy3-P3 片段;
图5为本发明SuSy3基因全长片段SuSy3-P4电泳图:泳道M.Marker DL5000，泳道A.SuSy3-P4 片段;
图6为不同植物SuSy氨基酸序列同源性比对图:深色(黑色)阴影代表氨基酸相似性是100%;浅色(灰色)阴影代表氨基酸相似性大于75%，(Tulipa gesneriana，CAA65640.1 ；Oncidium hybrid cultivar,AEA76429.1；Dendrobium off icinale,ADY02961.1；Musaacuminata,AE009338.2；Bambusa oldhamii,AAV64256.2.);
图7为本发明植物表达载体pMDC-SuSy3的构建流程图；
图8为植物表达载体pMDC-SuSy3的质粒PCR验证图:泳道M.Marker DLl5000，泳道A.SuSy3-P5片段，泳道B.GUS片段。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图对本发明做进一步的说明实施例1、百合SuSy3基因全长cDNA的克隆
步骤I 使用改良CTAB法(文献见African Journal of B1technology, 2011, 10
(78)，17907-17915)提取兰州百合鳞茎总RNA，电泳检测结果如图1所示。总RNA通过Promega公司的cDNA反转录试剂盒提供的M-MLV Reverse Transcriptase和Oligo d(T)s反转录得到cDNA。
[0017]步骤2对马铃薯、郁金香、水稻、石刁柏、拟南芥、小麦的SuSy基因进行比对分析，以保守区为模板，设计兼并引物SuSy3-Fl (5 ’ -HCCHATGRCNTTYAAYGTNG-3’)和SuSy3_Rl(5 ’ -THTCNAGNTTYGAWGTNTGG-3 ’)，其中 H= (A/T/C)，R= (A/G)，Y= (C/T)，N= (A/G/C/T)，W= (A/T)，以步骤I得到的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，目的产物Pl大小为750 bp(图2)，回收产物Pl，与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5a，得到阳性质粒pMD-SuSy3-Pl。
[0018]步骤3SuSy3基因5 ’端cDNA片段的获得:(I)以获得的SuSy3_Pl片段为模板，设计了 5 ’ RACE 弓I 物SuSy3-F2(5 ’-ATCCATTCATCCCATTGTC-3 ’)和SuSy3-R2(5 ’-GCATCAGGAAGCAACCTAGTC-3’)；(2)提取百合鳞茎总RNA，利用Invitrogen公司的5’RACE试剂盒提供的反转录酶Superscript II和5’RACE引物反转录成5’RACE cDNA; (3)之后以SuSy3_F2和SuSy3-R2为引物，以5 ’ RACE cDNA为模板，进行PCR获得产物P2，大小为1100 bp(图3);(4)回收产物P2，与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5a，得到阳性质粒pMD-SuSy3_P2。
[0019]步骤4: SuSy3基因3，端cDNA片段的获得:(I)以获得的PI片段为模板，设计引物GSP(5 ’ -AGTCTCACACTGCATTCACTCTACC-3 ’)；( 2)提取百合鳞茎总RNA，利用 Invitrogen公司的 3 ’RACE试剂盒提供的反转录酶superscript II和AAP引物反转录成3，RACE cDNA; (3)利用3 ’RACE试剂盒提供的AUAP和GSP(5 ’ -AGTCTCACACTGCATTCACTCTACC-3 ’)为引物，以3 ’ RACEcDNA为模板，进行PCR获得产物P3，大小为1200 bp(图4) ; (5)回收产物P3，与pMD18_T载体连接，转化大肠杆菌DH5a，得到阳性质粒pMD-SuSy3_P3。
[0020]步骤5: SuSy3基因的全长cDNA序列的获得:(I)通过生物信息学软件DNAMAN对所得到的百合SuSy3基因的P1、P2和P3片段进行序列拼接，得到SuSy3基因全长c