马铃薯卷叶病毒重组cp抗体在制备检测试纸条中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测马铃馨卷叶病毒的器具，特别是设及马铃馨卷叶病毒重组CP 抗体在制备检测试纸条中的应用。
【背景技术】
[0002] 马铃馨已成为世界第四大粮食作物，也是中国第四大主粮作物，现我国马铃馨种 植面积和产量均居世界首位，其对于我国的粮食安全具有重要作用。马铃馨卷叶病毒 (potato leaf roll virus化RV)是最重要的马铃馨病毒性病害，在所有种植马铃馨的国 家发生非常普遍，易感品种的产量损失可高达90 %，一般减产40 %-70%。该病毒通过晒虫 传播，也通过感染病毒的块茎传播。病毒通过晒虫W持久方式传播，其中桃晒（Myzus persicae)是最重要的传播介体，还能通过嫁接传播，但不能经汁液机械接种传毒。PLRV自 然寄主范围有限，20多种可侵染的寄主植物主要为茄科植物，还有部分宽科、假茄科 (Nolanaceae)、十字花科和马齿宽科植物。病毒具有非常好的免疫原性，与属内的甜菜西方 黄化病毒、甜菜轻型黄化病毒W及黄症病毒科未归类的烟草坏死矮化病毒、菜豆卷叶病毒 等有密切的血清学关系。感染病毒植株初期症状:上部叶片卷曲，尤其是小叶的基部。运些 叶片趋向于直立且一般是淡黄色。对许多品种而言，它们的颜色可能是紫色、粉红色或红 色。后期感染可能不会有症状，而且有些品种感染后并没有症状。高感品种的块茎馨肉中有 明显的坏死组织。当年初次侵染的症状，主要表现病株顶部的幼嫩叶片直立变黄，小叶沿中 脉向上卷曲，小叶基部着有紫红色。续发性为二次侵染（即用上年化RV初侵染块茎，在下年 做种再发病)侵染的病株症状，表现全植株病状较为严重，一般在马铃馨现蕾期W后，病株 叶片由下部至上部沿叶片中脉卷曲，呈匙状，叶肉变脆呈革质化，叶背又是出现紫红色，上 部叶片稱绿，重者全株叶片卷曲，整个植株矮化，块茎变瘦小，馨肉呈现诱色网纹斑。初侵染 病株减产程度小于续发性侵染病株。
[0003] 病毒病素有"蔬菜癌症"之称，防治十分困难，已成为制约蔬菜产业、乃至主要农作 物发展的重要因素对病毒性危害，仅通过增加投入，像防治细菌和真菌病害那样大量使用 农药是无法控制的。培育抗性品种是减少病毒危害最有效的手段之一。但由于自然界缺乏 抗病毒种质资源，抗病毒育种将是一个长期和艰巨的攻关目标。进行种馨脱毒是大幅度提 高马铃馨生产水平的重要环节，也是投入少、见效快的途径之一。而脱毒种馨的脱毒标准和 质量则直接影响脱毒种馨应用和推广的成效，对此国内外已达成广泛共识。建立有效的马 铃馨病毒检测体系、完善检测技术对提高馨类作物的产量具有重要意义。马铃馨病毒检测 需要利用病毒分离鉴定、血清学检测和病毒核酸检测等实验室检测手段进行确切诊断。
[0004] 目前实验室检测运Ξ种病毒的方法有：（1)指示植物法的病毒分离与鉴定，PLRV采 用带病毒晒虫接种洋酸浆或曼巧罗，其灵敏度高，但完成整个检测过程需1~2月，具有检测 周期长且技术要求高的局限性。（2)血清学检测主要包括琼脂免疫扩散试验(AGID)、酶联免 疫吸附试验化LISA)等。AGI的式验操作简便、敏感性高、成本低，不需要复杂实验设备，其缺 点是有交叉反应。DAS-ELISA是PLRV血清学诊断首选方法，是最敏感和特异的化RV抗体检测 技术，其缺点在于高亲和力单克隆抗体检测试剂不易获得。（3)用反转录一聚合酶链式反应 (RT-PCR)检测样品中的化RV核酸，RT-PCR和实时巧光定量PCR技术具有快速、特异、灵敏 及定量)等特点，在化RV核酸检测中得到广泛研究。病毒分离与鉴定和PCR检测技术操作复 杂、需要仪器和较长的时间，不适合生产或现场的快速诊断需要。ELISA和AGID比病毒分离 与鉴定和PCR技术简便、快速，常用来检测^RWELISA)及其抗体，但仍不便于我国基层或现 场普遍推广应用。因为化ISA仍需要酶标仪和试剂，较复杂的操作步骤和经验，运些仪器、试 剂在基层或者缺乏，或者缺乏操作人员和保存条件。用斑点免疫金渗滤法即免疫试纸的方 法检测病毒，利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，将抗原一抗体反应由化ISA的传统液 相环境转到固相滤膜上快速进行，并采用胶体金印迹代替酶印迹，凭肉眼直接观察胶体金 的显色状况而判断结果，因此该法比化ISA更简便、快速和实用。
[0005] 快速制备大量高效价的抗血清是免疫学方法应用的关键。日前应用于马铃馨病毒 抗血清制备的抗原有提纯病毒粒子及病毒外壳蛋白基因原核表达产物。W提纯的病毒粒子 为抗原制备抗血清是常规途径，过程是提纯抗原，再W提纯抗原免疫家兔，最后进行采血分 离抗血清。但是W提纯的病毒粒体为抗原制备抗血清存在很多弊端，一些病毒(如化RV)在 寄主体内含量低，病毒分离提纯困难，不易得到纯化的病毒粒体，难W提纯获得足够的抗 原。通过基因工程技术使病毒外壳蛋白基因在原核细胞中表达，W表达产物为抗原制备特 异性抗血清是一条制备病毒抗血清的新途径。该方法克服了使用提纯病毒粒体作为抗原制 备抗血清的种种弊端，同时可得到大量高特异性的抗血清，并且所构建的工程菌株可在低 溫下长期保存，根据需要随时诱导表达。通过表达载体的构建可将外壳蛋白表达为天然蛋 白或融合蛋白，研究表明两种类型的表达产物具有很好的免疫效果。马铃馨卷叶病毒CP基 因结构特殊，原核表达困难。Pichova等（2011)报道利用特殊的受体菌实现了化RV-CP基因 的原核表达，并制备了重组CP抗血清，但化ISA检测显示免疫反应信号弱。《马铃馨卷叶病毒 缺失突变CP基因的原核表达及抗血清的制备》公开了将化RV-CP基因进行缺失突变，实现了 其原核表达，并制备出了重组CP多克隆抗体，该抗体可用于化RV的DAS-化ISA检测；但是此 种方法基因表达量偏低，纯化较困难。并且目前未见马铃馨卷叶病毒重组CP单和/或多克隆 抗体用于组装化ISA检测试剂盒或胶体金试纸条的报道。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明提供一种祀T2化(+ )质粒在提高化RV-CP基因的表达 效率的应用。
[0007] 本发明采用W下技术方案：
[000引一种祀T22b( + )质粒在提高重组化RV-CP基因的表达效率的应用，所述重组化RV- CP基因为:从化RV-CP基因中删除第52-177位核巧酸（如序列表SEQ ID NO.2所示），其它核 巧酸没有改变，所述PLRV-CP基因如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0009] 一种重组载体，W祀T22b(+)质粒为起始载体，构建重组化RV-CP基因的原核表达 载体，所述重组化3￥-〔?基因为（如序列表56〇10^.2所示）：从化1?￥-〔?基因中删除第52- 177位核巧酸，其它核巧酸没有改变，所述PLRV-CP基因如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0010] 该重组载体的表达产物为20kDa(原来是34kDa)，只带有化S标签，没有其他融合片 段，减少了融合片段对抗体制备的干扰。
[0011] 本发明还提供含有上述重组载体的重组表达菌，所述重组表达菌其出发菌株为大 肠杆菌化21。
[0012] 本发明还提供采用上述重组载体表达马铃馨卷叶病毒重组CP抗原的制备方法，包 括如下步骤：
[OOU] (1)将载体片段祀T2化(+ )与126bp缺失突变后的化RV-CP基因进行连接，构建得到 表达载体祀T2化-LRCP;
[0014] (2)将步骤（1)中的表达载体祀T2化-LRCP转化至大肠杆菌，筛选阳性克隆，诱导表 达重组蛋白；
[0015] (3)大肠杆菌菌体总蛋白的提取和包涵体溶解，然后将目的蛋白LRCP进行纯化，即 得马铃馨卷叶病毒重组CP抗原。
[0016] 步骤(1)中，具体构建表达载体的步骤是：
[0017] l)WpBAD-LRCP-126为模板，W分别含有Nde I与Hind III位点的引物扩增CP基 因，然后T-A克隆，获得重组质粒PMD18-LRCP;
[001引 2)pMD18-LRCP进行Nde I与Hind III双酶切后回收含CP基因的DNA片段；pET22b- PhTPS同样进行Me I与化nd III双酶切，回收载体大片段；
[0019] 3)将步骤2)中的两个片段连接，即为产物化RV-CP基因（缺失突变基因）的原核表 达载体祀T2化-LRCP。
[0020] 步骤1)中，具体包括W下步骤：
[0021] ①从菌株 T0P10(pBAD-LRCP-126)提取质粒pBAD-LRCP-126;
[0022] ②PLRV-CP基因的PCR扩增
[0023] W质粒pBAD-LRCP-126为模板，WP1、P2(P1 序列为5' -CATATGAGTACGGTCGTGG-3'， 如序列表569 10^.3所示）；？2序列为5'-446(：1'1'1'刊66661'1'刊6〔44-3'，如序列表569 10 NO. 4所示)为上、下游引物，进行PCR扩增；
[0024] 扩增体系：质粒DNA，2化；P1，2.扣!^;P2，2.5化；dNTP，扣!^; 10 XPCR buffer，化!^; Taq酶，1化;(1地20，1^L
[0025] 扩增条件：94°C变性5min，然后进入循环：94°C，变性30s; 46°C，退火45s; 72°C，延 伸lmin"34个循环，最后72°C保溫10min;l%琼脂糖凝胶电泳检测PCR的扩增结果。
[0026] ③PLRV-CP基因的回收
[0027] 在紫外灯下切下大小为5(K)bp左右的特异性DNA片段的胶条，称重后加入胶条重量 3-6倍的buff er B2，50°C水浴5-lOmin，融化胶条;溶液移入吸附柱中，8000 X g离屯、30s;加 500μΙ Wash Solution ,9000 X g离屯、30s并重复洗涂一次;空吸附柱9000 X g离屯、Imin;吸附 柱放进 1.5mL离屯、管中，加入 15-40μΙ Elution Solution,静置lmin，9000Xg离屯、30s。
[0028] ④T-A连接
[00巧]连接体系：pMDlST载体化L，化RV-CP基因小片段：3yL，连接Solution化L，dd出ο?μ L。金属浴中16°C保溫30min。
[0030] ⑤D册α感受态制备及其转化，获得D册a(pMDlS-LRCP)，经培养后，提取得到重组质 粒PMD18-LRCP。
[0031 ]步骤2)中，回收含CP基因的DNA片段的具体步骤如下：
[0032] ①对重组质粒PMD18-LRCP进行双酶切，酶切体系如下：质粒祉LNde nyLWnd虹 化UBuffer Κ化L，dd出ο化L，37°C，保溫6小时；
[0033] ②酶切产物于浓度为1 %的琼脂糖凝胶中电泳，电极缓冲液和琼脂糖凝胶使用TAE 缓冲液配置，琼脂糖溶解后加入邸使其终浓度达到约0.化L/mL
[0034] ③在紫外灯下切下目的条带的胶条，回收大小约为5(K)bp的CP基因的DM片段。
[0035] 步骤2)中，载体祀T2化(+ )大片段制备方法如下：
[0036] 从重组菌D册a(pET22b-I%TPS)提取质粒祀T2化-PhTPS，经过Nde I与Hind虹双酶 切后，回收大小约为5500bp的载体祀T2化(+ )大片段。其中，重组菌D册a(pET22b-化TPS)的 构建通过常规基因工程的方法进行，其构建来源于文献所述:《坛紫菜TPS基因的克隆及其 原核表达》邓淑贞，王斌，高磊，牛倩雅，刘涛，翁曼丽，郭宝太，华北农学报2013，28(5):: 66- 73。
[0037] 步骤3)中，两个片段连接方法如下：
[003引连接体系（20化）：祀T2化载体大片段化L，PLRV-CP基因小片段6化，DNA连接酶化L， 连接Buffer化L，dd出0化L，金属浴中16°C过夜连接。
[0039] 步骤(2)中，优选大肠杆菌化21，E.coli化