一种耐油污微藻的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微藻筛选领域，具体设及一种高通量筛选耐油污微藻的方法。
【背景技术】
[0002] 来源于生活污水、石油泄露、溢油及石油工业化学制品等的油污，是水体富营养化 重要的有机污染源。因此，油污水处理是水质保护和治理的一个重要目标。在消减工业油污 水排放、生活污水治理等领域，将耐油微藻或可利用油污组分的微藻接种到油污水中，一方 面微藻的增殖利用可消减油污，另一方面增殖的微藻生物量可W用于开发进一步的生物质 应用。而筛选合适的微藻是一个重要的环节，其中，微藻对油污的耐受性分析是一个重要方 法。
[0003] 但是，油污水是一类复杂的多源性污染物，来源于生活污水的、石油开采慢漏的、 突发性溢油的、石油化工的污染排放的、或其他生产劳动过程中排放的油污，其组分在各时 间、各案例中都可能各不相同；同时，油污染浓度的不同，也对微藻增殖造成不同影响。另 夕h自然界中的微藻种类繁多，不同种类的微藻，受复杂多样的油污染源影响时，其细胞增 殖、生理生化参数变化特征都是不同的；在不同季节、不同营养盐环境条件、不同的起始生 物量对油污染的响应差异也显著不同。
[0004] 可见，在筛选耐油污微藻时，需设置油污染和微藻的多维度互作实验组，因此，筛 选和分析时，在方法学上具有显著的复杂性，常出现大量实验组W及产生复杂的数据关系， 工作量大，数据量大且关系复杂，从而易造成结论的不确定性、W及筛查范围、筛查对象局 限性。
【发明内容】
[000引本发明提供了一种高通量筛选耐油污微藻的方法，可W高效的筛查高通量筛选耐 油污微藻从而弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明的方法，包括如下的步骤：
[0007] 1)首先，分别将待检测的已经纯化的单种微藻，分别加入到已添加不同浓度的待 检测油水的培养基中进行微藻的增殖培养作为耐油污检测组;并设置2-6个平行样；
[0008] 2)同时，将对应微藻分别加入无油污的正常微藻培养基中，在相同条件下进行微 藻的增殖培养，作为空白对照组;设置2-6个平行样；
[0009] 3)对全部微藻在相同的环境条件下进行一次培养方式的增殖培养，对微藻生物量 变化进行每天连续检测，获得各组每天的生物量变化数据；
[0010] 4) 一次培养结束后，利用Simca-P计算机软件对全部数据进行主成分分析(PCA);
[0011] 5)结果的判别
[001引根据PCA图分析，与空白对照组明显分开的微藻为受到对应油污染影响严重的种 类，为不耐油污种类;与空白对照组不能分开或分开无显著性的，为耐油污种类。
[0013]所述的微藻，指来源于淡水、海水、咸水或其他水域环境中的、已经纯化的可培养 的单细胞自养微藻或具有异养能力的微藻；
[0014] 所述的油污水，指各种来源的油污染水，包括生活污水、石油工业污水来源的石油 化学品油污水、特殊劳动或生产工艺过程中排放的油污水等;或已经明确化学成分的油污 水；
[0015] 所述培养基，指常用适宜微藻增殖的培养基，如f/2培养基，或在培养介质中添加 利于特异微藻正常增殖营养需求的培养基；
[0016] 所述导入Simca-p软件的数据整理，指将观测的生物量数据作为X变量，实验组别 信息作为Y变量，导入Simca-p软件。
[0017] 本发明的方法，可W在筛选实验中，根据微藻和油污水的特征，设置足够多的实验 组别:构建微藻种类、不同起始密度与油污水不同处理、不同浓度在不同培养条件下的多维 度相互关系实验组，应用Simca-p软件的大数据分析能力，从而可W确定出典型条件下耐受 油污的微藻。
【附图说明】
[0018] 图1:4个微藻在4种石油化学品3个浓度下的生物量变化图；
[0019] 图2:微藻对不同石油化学品响应的PCA图。
【具体实施方式】
[0020] 在透明多孔培养板上，将待检测的不同油污水制备的油水培养基，与不同目标微 藻混合，形成油污实验组;将对应微藻接种至适宜微藻增殖的无油污微藻培养基中，作为空 白对照组，在相同的环境条件下，进行一次培养。每天检测各培养孔中68化m或对应微藻吸 收峰值处的吸光值，对微藻生物量变化进行连续跟踪。收集全部数据后，利用Simca-p计算 机软件(>12，1]1116化；!^3,5￥6(16]1)对全部数据进行主成分分析。〔4):将观测值(吸光值或对 应的生物量值)作为X变量，实验组别信息作为Y变量，导入Simca-p，选用CTR Scanning模 式，运行程序。从得到的PCA中，分析油污组与对照组之间的差异显著性:油污实验组与空白 对照组显著分开的微藻，表示该微藻受油污影响大，不耐受油污；油污实验组与空白对照 组不能分开的，表示该微藻不受油污影响，为耐油污微藻。
[0021] 根据实际培养的微藻正常增殖的需要，可W将多孔培养板置换成小体积培养瓶， 则检测生物量时，可将直接读取多孔板上的吸光值改为取样检测细胞数、吸光值或其他可 表征生物量变化的定量指标。
[0022] 实施例1:
[0023] 1)将4种纯化培养的海洋微藻，包括:柔弱角刺藻、球等鞭金藻、东海原甲藻、剧毒 卡罗藻，正常培养至指数期;将待检测的油水样品（双酪、对苯二甲酸、对二甲苯)溶于f/2藻 类培养基中，形成浓度分别为0.1 ppm、Ippm和lOppm的油水培养基;将油水培养液与藻液按 照1:1比例分别置于24孔板中，开多成油污终浓度为0.05ppm、0.5ppm和5ppm油藻混合液，各处 理各2平行。
[0024] 2)同期，将不同种微藻分别对应加至无添加油水样品的f/2培养基，作为空白对照 组，各2平行；
[0025] 3)将24孔板置于溫度为18-20°C，光照为35-85皿ol/m2 · S化:D = 12h:12h)的培养 室中进行培养；
[0026] 4)在一次培养过程中，每天用多功能酶标仪检测各藻液在680nm波长处吸光值变 化；
[0027] 5)收集全部数据后，指将观测的生物量数据作为X变量，实验组别信息作为Y变量， 导入Simca-P软件。利用Simca-P计算机软件对全部数据进行主成分分析(PCA)。原始数据见 下表。
[002引
[0029]
[0030]
[0031] 6)结果的判别
[0032] 利用Excel数据分析，获得4个微藻在4种石油化学品3个浓度下的生物量变化情况 如图1所示。从图1可见，柔弱角刺藻(Chaetoceros debilis)在不同实验浓度的巧巾石油化 学品影响下，增殖程度有差异，对于高浓度（5ppm)石油化学品增殖影响不显著，低浓度 (0.05ppm)影响下，并没有促进其增殖;而中浓度(0.5ppm)影响下，双酪促进其增殖，其他两 种石油化学品对二甲苯，对苯二甲酸对其有不同程度的抑制影响。球等鞭金藻（Isocrysis ga化ana)对于高浓度(5ppm)石油化学品增殖影响波动较大，中，低浓度(0.5ppm和0.05ppm) 影响相似，对二甲苯和对苯二甲酸对其有不同程度促进影响，而双酪有一定程度抑制增殖 影响。对于两种甲藻，东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense)和剧毒卡罗藻 化arlodinium veneficum)对于不同浓度石油化学品影响有一定相似性:高浓度(5ppm)对 于增殖影响波动较大，而中，低浓度(0.5ppm和0.05ppm)影响相似，3种石油化学品对其增殖 都有一定抑制作用。
[0033] 但是，油污与微藻之间的明确关系并不能一目了然，没有判定结论。利用Simca-P 数据分析软件得到的PCA图如图2。相对于空白对照组，同一种微藻对不同石油化学品响应 存在差异，柔弱角刺藻受对苯二甲酸影响与对照组无明显差异，而双酪、对二甲苯则影响明 显；球等鞭金藻受对二甲苯影响与对照组无明显差异，而双酪、对苯二甲酸则影响显著，不 与对照聚在一起。东海原甲藻受对二甲苯影响与对照组无明显差异，而双酪、对苯二甲酸则 影响明显。剧毒卡罗藻受双酪、对二甲苯、对苯二甲酸影响与对照组均有明显差异，说明3种 石油化学品对该藻均具有显著影响。因此，通过设置各实验组及其对照组，利用该大数据分 析软件，可W判定:柔弱角刺藻为对苯二甲酸耐受微藻，球等鞭金藻和东海原甲藻为对二甲 苯耐受微藻，而剧毒卡罗藻对巧巾微藻均不耐受。
[0034]上述的结果表明本发明的方法可W有效的筛选出耐受油污的微藻。
【主权项】
1. 一种高通量筛选耐油污微藻的方法，其特征在于，所述的方法，包括如下的步骤： 1) 首先，分别将待检测的已经纯化的单种微藻，分别加入到已添加不同浓度的待检测 油水的培养基中进行增殖培养作为耐油污检测组； 2) 同时，将对应微藻分别加入无油污的微藻培养基中，在相同条件下进行增殖培养，作 为空白对照组； 3) 对全部微藻在相同的环境条件下进行一次培养方式的增殖培养，对微藻生物量变化 进行每天连续检测，获得各组每天的生物量变化数据； 4) 一次培养结束后，利用Simca-P计算机软件对全部数据进行主成分分析(PCA); 5) 结果的判别 根据PCA图分析，与空白对照组明显分开的微藻为受到对应油污染影响严重的种类，为 不耐油污种类;与空白对照组不能分开或分开无显著性的，为耐油污种类。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的耐油污检测组和空白对照组设置2-6 个平行样。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微藻可培养的单细胞自养微藻或具有 异养能力的微藻。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油污水，指各种来源的油污染水，包括 生活污水、石油工业污水来源的石油化学品油污水、特殊劳动或生产工艺过程中排放的油 污水等;或已经明确化学成分的油污水。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基为适宜微藻增殖的培养基。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培养基为f/2培养基。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基为在培养介质中添加利于特异 微藻正常增殖营养需求的培养基。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的导入Simca-P软件的数据整理，指将观 测的生物量数据作为X变量，实验组别信息作为Y变量，导入Simca-P软件。
【专利摘要】本发明提供了一种高通量筛选耐油污微藻的方法，可以高效的筛查高通量筛选耐油污微藻。本发明利用小体积微藻培养方法，在微藻一次培养过程中，采集微藻增殖全过程数据，应用大数据分析软件Simca-P，对根据不同需要设置的不同条件组合的油-藻互作关系进行分析，通过运行软件分析获得的PCA图，能得到明确的筛选结论。本发明的方法，可以在筛选实验中，根据微藻和油污水的特征，设置足够多的实验组别：构建微藻种类、不同起始密度与油污水不同处理、不同浓度在不同培养条件下的多维度相互关系实验组，应用Simca-P软件的大数据分析能力，从而可以确定出典型条件下耐受油污的微藻。
【IPC分类】C02F3/32, C12Q1/04, C12R1/89, C02F103/34
【公开号】CN105543324
【申请号】CN201610041317
【发明人】杨小倩, 周成旭, 耿沙沙, 叶央芳, 骆其君, 严小军, 蒋莹, 马斌
【申请人】宁波大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月21日