一种检测赭曲霉毒素a的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属纳米生物传感以及生物检测技术领域，涉及一种检测赭曲霉毒素A的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]赭曲霉毒素包括7种结构类似的化合物，结构通式:R1 = C1SH;R2 = H、CH3SC2H5。其中赭曲霉毒素A(R1=C1，R2 = H)毒性最大，在霉变谷物、饲料等最常见。
[0003]赭曲霉毒素A是一种无色结晶化合物。可溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液。微溶于水。其苯溶剂化物熔点94?96°C，二甲苯中结晶熔点169°C。有光学活性[a]D-118°。其紫外吸收光谱随PH值和溶剂极性不同而有别，在乙醇溶液中最大吸收波长为213nm和332nm。有很高的化学稳定性和热稳定性。赭曲霉毒素A是由多种生长在粮食(小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等)、花生、蔬菜(豆类)等农作物上的曲霉和青霉产生的。动物摄入了霉变的饲料后，这种毒素也可能出现在猪和母鸡等的肉中。赭曲霉毒素主要侵害动物肝脏与肾脏。这种毒素主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死。还在动物试验中观察到它的致畸作用。
[0004]因此对赭曲霉毒素A的检测是十分必要的。
[0005]目前，对赭曲霉毒素A检测方法主要是色谱技术，包括薄层色谱(TLC)，气相色谱(GC)，高效液相色谱(HPLC)，液相色谱-质谱联用(LC-MS)等。近年来，发展了基于核酸适体的真菌毒素新的检测方法。如B1sensors and B1electronics 57(2014)226-231 公开了一种用于赭曲霉毒素A的检测的基于DNA骨架的银纳米簇的荧光适体传感器(AFluorescent Aptasensor based on DNA—scaffolded Silver-nanocluster forOchratoxin A Detect1n)。
[0006]中国专利CN102830113B公开了一种目标诱导链释放和限制性内切酶酶切循环的信号放大技术在赭曲霉素A超灵敏度检测中的应用。
[0007]中国专利CN102517288A公开了一种赭曲霉毒素A核酸适体及其应用，该核酸适体可以用于赭曲霉毒素A的检测分析和分离富集。
[0008]通常，色谱法用于食品中痕量真菌检测存在灵敏度不够的问题，液-质联用法虽然灵敏度高、快速，但设备昂贵、应具有专门操作技术人员才能进行检测，技术要求高，不宜大众化和普及，而文献所述的基于核酸适体检测赭曲霉真菌毒素方法或存需要用到价格昂贵的经标记(生物材料等)的DNA，或操作复杂等不足之处。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是针对上述现有技术中存在的问题，提供一种快速、简便检测赭曲霉毒素的方法，所述方法包括:
[0010](A)使抗赭曲霉毒素A核酸适体(Apt)和可与抗赭曲霉毒素A核酸适体杂交的单链信号探针DNA(Sp)杂交，形成杂交链；
[0011](B)使该杂交链与待测样品接触，当待测样品中有赭曲霉毒素A存在时，杂交链与赭曲霉毒素A反应释放出单链信号探针DNA;
[0012](C)为了消除杂交链的干扰，利用DNA扩增使杂交链成双链DNA，用外切酶，将双链DNA切成碎片，留下单链信号探针DNA;
[0013](D)利用银离子在抗赭曲霉毒素A核酸适体-赭曲霉毒素A的结合体中不能还原生成荧光发射峰在650nm左右的银纳米簇，只有单链信号探针DNA(Sp)中银离子还原并生成被(Sp)修饰的荧光发射峰在650nm左右的银纳米簇的原理，在银离子还原检测体系中检测体系荧光强度，测定生物毒素赭曲霉毒素A的含量。
[0014]在本发明中，所述银离子还原检测体系包括先后添加的银离子和使银离子迅速还原成单质银的还原剂，例如硼氢化物例如硼氢化钠。步骤(D)的检测例如包括依次先后向体系中加入银离子溶液和硼氢化钠溶液，反应后生成荧光发射峰在650nm左右的银纳米簇。
[0015]在一个实施方式中，所述抗赭曲霉毒素A核酸适体为GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC。
[0016]在一个实施方式中，所述单链信号探针DNA(Sp)为CCCTTACCCCGGTGTCCCATGCTCCC。
[0017]本发明的方法的检测原理如下:抗赭曲霉毒素A核酸适体(Apt)与单链信号探针DNA(Sp)杂交(下划线部分)；当有赭曲霉毒素A存在时，杂交链与赭曲霉毒素A反应释放出Sp;体系中有Apt-Sp(剩余的)，Apt-赭曲霉毒素A和Sp ；银离子在Apt-赭曲霉毒素A体系中不能还原生成焚光发射峰在650nm左右的银纳米簇，Apt-赭曲霉毒素A的存在对测定无干扰；杂交链可能有干扰;为了消除杂交链的干扰:a.利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b.用外切酶，将双链DNA切成碎片。此时体系中只留下信号探针DNA，再先后向该体系中加入银离子溶液和硼氢化钠溶液，此时，溶液中生成荧光发射峰在650nm左右的Sp修饰银纳米簇，通过检测体系荧光强度，测定真菌毒素赭曲霉毒素A的含量。
[0018]本发明另外提供了一种用于检测赭曲霉毒素A的试剂盒，其至少包括:抗赭曲霉毒素A核酸适体，可与抗赭曲霉毒素A核酸适体杂交的单链信号探针DNA，DNA扩增体系、外切酶、银离子还原检测体系。
[0019]在上述试剂盒的一个实施方式中，所述抗赭曲霉毒素A核酸适体为GATCGGGTGTGGGT GGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC。
[0020]在上述试剂盒的一个实施方式中，所述单链信号探针DNA(Sp)为CCCTTACCCCGGTGTCCCATGCTCCC。
[0021]在一个实施方式中，所述DNA扩增体系包括缓冲溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2S04)三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液(dNTP)和Phi29DNA聚合酶。
[0022]在一个实施方式中，所述外切酶为ExoIII核酸外切酶。
[0023]本发明还提供了一种用于检测赭曲霉毒素A的抗赭曲霉毒素A核酸适体，其碱基序列为GATCGGGTGTGGGT GGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC。
[0024]本发明的优点
[0025]根据本发明的检测方法和试剂盒，方法简单、易于操作、并可以消除背景荧光的干扰，提尚赫曲霉毒素A的检测灵敏度和精度。
【附图说明】
[0026]图1为Sp修饰银纳米簇的荧光激发与发射光谱。
【具体实施方式】
[0027]以下通过【具体实施方式】来说明本发明。
[0028]本发明的用于检测赭曲霉毒素A的试剂盒至少包括:抗赭曲霉毒素A核酸适体，可与抗赭曲霉毒素A核酸适体杂交的单链信号探针DNA，DNA扩增体系、外切酶、银离子还原检测体系。
[0029]在上述试剂盒的一个实施方式中，所述抗赭曲霉毒素A核酸适体为GATCGGGTGTG