一种同时检测il28b和itpa基因多态性的引物及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及一种同时检测IL28B和口 ΡΑ基因多态性 的引物及其方法。
【背景技术】
[0002] 丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎，是一种由丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus, HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要通过血液传播。由于大部分感染丙肝病毒的患者在感染 的急性期无明显症状，因此常常被人们忽视，一般待丙型肝炎转化为慢性丙型肝炎或肝硬 化等顽固疾病时才有所察觉，运样往往会错过丙型肝炎的最佳治疗期。据世界卫生组织统 计，全球约有1.4-1.7亿HCV感染者，我国HCV感染率约为3.2%，约有3800万HCV感染者，而且 每年呈上升的趋势，严重危害人类的健康。
[0003] 2009年，杜克大学的Ge等在《自然》上发表了一篇与HCV感染相关的全基因组相关 性(genomewide association study,GWAS)研究论著，报道了IL28B基因位于第19号染色体 短臂（19ql3)，其编码干扰素 A3(IL28B)上游约3化附近的单核巧酸多态性rsl2979860与聚 已二醇干扰素、利己韦林联合治疗的效果显著相关。在1型HCV感染者中，C/C基因型患者的 SVR是CA和ΤΛ型患者的两倍。C/C基因型在人群中的分布呈现明显的种族差异，在黄色人 种中占90%、在白色人种中占51%、在黑色人种中占13%。
[0004] 杜克大学的同一研究组在发现IL28B基因型具有预测抗病毒治疗应答的基础上， 通过6￥45研究发现，肌巧腺巧^憐酸酶（;[]1〇3；[]1日日(1日]1〇3；[]10付;[曲日1日3日，口?4)基因变异可 缓解RBV引起的溶血性贫血，如rsll27354AA和rs7270101CC基因型均为贫血的保护性因子。 因此，通过检测IL28B和口PA基因多态性有利于预测HCV患者的疗效。
[0005] 中国专利申请201510007333.1公开了基于实时巧光PCR的IL28B基因多态性检测 试剂盒，所述试剂盒包括IL28B rs8099917型PCR反应液、IL28B rsl2979860型PCR反应液， 其通过提取DNA，加入到基于实时巧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒的反应液中，利用实时巧 光PCR仪进行检测，通过巧光扩增曲线来判读位点突变类型。
[0006] 中国专利申请 201210353290.9 公开了检测 IL28B(rs8099917)和 ITPA (rsl 127354)的突变的方法，其多态性检测用探针包含P1或ΡΓ的寡核巧酸、P2或P2'的寡核 巧酸W及P3或P3 '的寡核巧酸，其是通过将探针进行PCR扩增后进行Tm分析，对IL28B基因 多态性的rs8099917和口PA基因多态性的rsll27354进行分型。
[0007] 虽然目前的检测方法可W对IL28B和口 PA进行分型，但是上述方法存在检测结果 误差较大，重复性较低，而且结果判断较复杂的缺陷。因此，研究和开发出一种操作简单，检 测结果误差小，结果重复性高的IL28B基因和口 PA基因的检测方法仍是目前研究的热点。
【发明内容】
[0008] 为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种同时检测IL28B和ITPA基因多 态性的引物及其方法，该引物主要用于检测化288_'312979860、口口4_'37270101、和口口八_ rsll27354S个位点，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，为IL28B和口PA基因多态 性提供了一种简单有效的检测方法。
[0009] 本发明提供了 一种同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和 SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对IL28B9860的上游引物5 ' - GTCGTGCCTGTCGTGTACT-3'（沈Q ID N0.1)和下游引物5'- TCAGGGTCAATCACAGAAGGG-3'（沈Q 10側.2)，针对口口4的上游引物5'-66464了666〔46〔46467^-3'（沈9 10側.3)和下游引物 5'-CAGGTCACAGGAAGACAGAGA-3'（SEQIDN0.4);所述SNaPshotPCR引物包括：针对 IL28B9860的SNaPshot PCR引物5 ' - AAAAAAAAAAAAAATGCGGAGTGCAATTCAACCCTGGTTC-3 ' (SEQ ID N0.5)，针对ITPA0101的SNaPshot PCR 弓| 物 5'- AAAAAAAAAAAAGATCGATCGAGAAATCCAACCATCTTTTAAAAA-3'（沈Q ID ^.6)，针对口口47354的 SfePshot PCR 引物5 ' - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATTTTCTGTGCCACCAAAGTGCAT G-3'（沈Q ID N0.7)。
[0010] 进一步地，所述PCR扩增引物中IL28B9860和口PA的引物浓度比为1 : 1，所述 SNaPshot PCR引物中IL28B986〇aTPA0101 和口PA7354的引物浓度比为1:1:1。
[0011] 另外，本发明提供了一种同时检测IL28B和ITPA基因多态性的方法，包括如下步 骤： S1提取DNA样品； S2W步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR 扩增，并对扩增产物进行纯化； S3W步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物 进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化； S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
[0012] 进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为邸TA抗凝外周血的DNA样品。
[0013] 进一步地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括:阶段1:98°C 3min;阶段2: 98°C 10s;阶段3:58°C 30s;阶段4:72°C Imin;阶段5:返回到阶段2,29个循环;阶段6:72°C 5min;阶段7:25°C保溫。
[0014] 进一步地，所述步骤S3中的挪aPshot PCR扩增反应条件包括:阶段1:96°C 10s;阶 段2:55°C 5s;阶段3:60°C 30s;阶段4:返回到阶段1，25个循环;阶段5:4°C保溫。
[001引进一步地，所述步骤S4中采用GE肥MAPP邸ID V4.1软件对检测结果进行分析。
[0016] 除此之外，本发明提供的同时检测IL28B和ITPA基因多态性的引物在制备检测 IL28B和口PA基因多态性试剂中的用途。
[0017] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有W下优势:本发明提供的同时检测 IL28B和口PA基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现 了同时检测IL28B和口PA基因多态性的检测，可用于指导利己韦林的用量调整，W提高抗病 毒治疗的反应，同时也可W为临床预测丙型肝炎抗病毒个体化治疗效果提供依据，具有重 大的社会意义。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明提供的IL28B9860基因引物的扩增片段； 图2为本发明提供的口 PA基因引物的扩增片段； 图3为本发明提供的IL28B和口PA基因 SNaPshot PCR引物的检测结果图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0020] 实施例一、引物 本发明提供的IL28B和ITPA基因引物如表1所示，包括PCR扩增引物和挪aPshot PCR引 物，所述PCR扩增引物和挪aPshot PCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过 UCSC数据库比对，无已知SNP位点。
[0021] 表1本发明提供的引物
实施例二、引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasti