一种棘颚口线虫的lamp检测引物组及检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分子生物学技术领域，涉及食品安全的检测方法，具体地，涉及一种棘颚口线虫的LAMP检测引物组及检测方法。
【背景技术】
[0002]颚口线虫病是人感染颚口线虫属线虫的幼虫而引起的疾病，主要由于食入生的或未熟的含有颚口线虫的淡水鱼。它能够引起人的移行性皮下包块，还可侵袭深部组织和器官，如肺、眼、肝、肾等，甚至神经系统，引起严重症状。颚口线虫有13个种，已报道的致病种有6个，其中，双核鄂口线虫主要在中南美洲地区流行，棘颚口线虫则广泛存在于亚洲，是主要引起亚洲颚口线虫病的虫种。自1989年Levinson在泰国发现并报道了第一例棘颚口线虫病后，国际上感染颚口线虫的病例越来越多，在几个严重的国家还发生过爆发流行的情况，所以日益受到医学上的重视。而棘颚口线虫病还没有根治的治疗方法。联合国粮农组织(FAO)已将颚口线虫列为重要的致病因子。随着人口流动、文化以及国际贸易全球化，颚口线虫病呈现全球化的趋势，已有非流行地区的游客在流行地区感染颚口线虫病，或者消费进口的民族风味食品而感染颚口线虫病的报。
[0003]颚口线虫病主要由棘颚口线虫第三期幼虫引起，特别是在亚洲地区，据调查，棘颚口线虫普遍存在于东南亚地区，美国从东南亚地区进口的黄鳝感染的颚口线虫全部为棘颚口线虫，根据本实验检测的进口黄鳝中感染的颚口线虫也全部为棘颚口线虫。如果鱼类感染棘颚口线虫将直接威胁到人民的健康安全，造成颚口线虫的传播。
[0004]为了能够更好地检测棘颚口线虫，控制其传播和感染，快速准确的检测方法是必不可少的。传统的颚口线虫种类的鉴别方法是利用其形态特征，但颚口线虫的生活史复杂，不同发育阶段的形态不同，虫种间的第三期幼虫的形态相似，用传统的形态学方法很难鉴别棘颚口线虫，而且传统方法费时费力，需要专业人员和专用设备才能完成。利用分子生物学方法鉴定虫种的方法不断发展，如PCR技术。但PCR需要测序才能完成棘颚口线虫的鉴别，周期漫长，而且需要昂贵的仪器设备，也很难在基层推广。同时由于虫体样本复杂，虫体本身过小，对假阴性的检测结果没有控制，存在漏检的可能。因棘颚口线虫危害严重，漏检造成的危害无法估量。为减少漏检造成概率，史贤明教授等申请一项添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法(专利号:200710040001.9)，通过内标的检测结果判断是否发生假阴性。但荧光PCR扩增需要昂贵的仪器，很多基层检测单位不具备相应检测条件。因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。
[0005]棘颗口线虫作为食品卫生检验一项重要寄生虫，提尚棘颗口线虫检出率，缩短检测时间，防止因样品复杂性、抑制因子多等原因等抑制反应而发生漏检的现象发生，对保证食品的安全性和消费者的身体健康具有重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明针对现有技术的不足，提供了一种棘颚口线虫的LAMP检测引物组，包括ITS2检测引物组和质控引物组，根据ITS2、质控引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，提高检测的准确性。本发明采用环介导等温扩增技术，在恒温条件下实现对靶标基因的扩增，通过质控检测，可有效的检测到假阴性的检测结果，同时环介导等温扩增技术整体检测成本低，有利于基层的推广与应用。
[0007]本发明的另一目的在于提供一种棘颚口线虫的LAMP检测方法。
[0008]本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
[0009]一种棘颚口线虫的LAMP检测引物组，包括IT S 2检测引物组和质控引物组，其中，ITS2检测引物组根据棘颚口线虫ITS2 rDNA基因设计，包括核苷酸序列如SEQ ID勵:1~2所示的一对外引物、核苷酸序列如SEQ ID N0:3?4所示的一对内引物以及核苷酸序列如SEQID NO:5?6所示的一对环引物:
G.Sp1-F3:CGAGAGGAGATGTCTAGCACSEQ ID NO:1);
G.Sp1-B3:TCCTCGTCAAGGCGATAA(SEQ ID N0:2)；
G.Sp1-FIP:AGCATCAACATCATCGTCACCAATCTCTTATCGAGGTGCGTA(SEQ ID NO:3);
G.Sp1-BIP:TTTGTGGCAAACGTTGAGGAACAATAACGACGACATCACCG (SEQ ID NO:4);
G.Sp1-LF:GCTACCATTTCCCGACGAT(SEQ ID NO:5);
G.Sp1-LB:ACGGGGAATATCATGCTACAAA(SEQ ID NO:6);
质控引物组根据颚口线虫属28S rDNA设计，包括核苷酸序列如SEQ ID N0:7?8所示的一对外引物、核苷酸序列如SEQ ID N0:9?10所示的一对内引物以及核苷酸序列如SEQ IDNO: 11?12所示的一对环引物:
Gna-F3:TGTGGAGCTGTAGCGTATACSEQ ID N0:7)；
Gna-B3:GGTACTTGTTCGCTATCGG (SEQ ID NO:8);
Gna-FIP:CTCGACCGCACAGGTCTCGATGCTCGACCGAAGTTCCSEQ ID N0:9)；
Gna-BIP:CCTTGGAGTCGGGTTGCCTCTCGTGTCGATACTTAGTCTCSEQ ID NO:10)；
Gna-LF:CACCTACTTCGGACAGTGGCSEQ ID NO:11);
Gna-LB:CGAAGATGGTGGTAAACCTCACSEQ ID NO:12)。
[0010]针对棘颚口线虫的LAMP检测，本发明设计了ITS2检测引物组和质控引物组的引物序列，发明人在前期研究中对引物组序列进行了大量的筛选，只有本发明限定的引物组序列才能达到高特异性、高灵敏度的检测效果;而改变引物序列，将直接影响对棘颚口线虫检测的灵敏性和准确性。
[0011]本发明还提供一种棘颚口线虫的LAMP检测方法，所述检测方法包括所述的ITS2检测引物组和质控引物组。
[0012]优选地，检测组利用ITS2检测引物组扩增基因的实时荧光反应体系及条件:25μ1反应体系含有:一对外引物(6.3?^3，6.3?^3)各0.24]?，一对内引物(6.3?^1?，6.3?1-BIP)各1.6μΜ，一对环引物(G.Sp1-LF，G.Sp1-LB)各0.8μΜ，8mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、120mM MgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，10XSYBR Green I 0.5μ1，待检样品2μ1，用超纯水补齐到25μ1，加20μ1密封液;设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于63°C反应30?45min，并在80°C持续2min ；
质控组利用质控引物组扩增基因的实时荧光反应体系及条件:25μ1反应体系含有:一对外引物(Gna-F3，Gna-B3)各 0.2μΜ，一对内引物(Gna-FIP，Gna-BIP)各 1.6μΜ，一对环引物(Gna-LF，Gna-LB)各0.8μΜ，8mM dNTP、10XThermoPoI反应缓冲液、120mM MgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，10XSYBR Green I 0.5μ1，待检样品2μ1，用超纯水补齐到25μ1，加20μ1密封液;设置阳性对照和阴性对照;将配制好的反应管混匀后离心，并于63°C反应30?45min，并在80°C 持续 2min。
[0013]优选地，检测组利用ITS2检测引物组扩增基因的显色液反应体系及条件:25μ1反应体系含有:一对外引物(6.3?^3，6.3?^3)各0.24]?，一对内引物(6.3?^1?，6.3?1-BIP)各1.6μΜ，一对环引物(G.Sp1-LF，G.Sp1-LB)各0.8μΜ，8mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、120mM MgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，待检样品2μ1，用超纯水补齐到25μ1，加20μ1密封液;设置阳性对照和阴性对照;将配制好的反应管混匀后离心，将?μ?显色液滴在反应管盖中间，并于63°C反应30?45min，并在80°C持续2min;
质控组利用质控引物组扩增基因的显色反应体系及条件:25μ1反应体系含有:一对外引物(Gna-F3，Gna-B3 )各0.2μΜ，一对内引物(Gna-F IP，Gna-B IP )各 I.6μΜ，一对环引物(Gna-LF，Gna-LB)各0.8μΜ，8mM dNTP、1 X ThermoPo I 反应缓冲液、120mM MgSO4水溶液，DNA聚合酶8U，待检样品2μ1，用超纯水补齐到25μ1，加20μ1密封液;设置阳性对照和阴性对照;将配制好的反应管混匀后离心，将Ιμ?显色液滴在反应管盖中间，并于63°C反应30?45min，并在80°C 持续 2min。
[0014]优选地，扩增反应结束后，颜色变绿则为阳性。
[0015]优选地，所述检测方法包括如下步骤:
51.处理样品，寻找虫体，提取样品的基因组DNA;
52.按照所述的反应体系配制棘颚口线虫LAMP检测的反应体系；
53.检测分析:根据实时读取的荧光信号或者显色液颜色变化来判断扩增结果，如果检测组及质控组检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
如果检测组检测结果为阴性，质控组检测结果全为阳性时，检测结果为阴性，判断样品为颚口线虫属非棘颚口线虫种；
检测组检测结果为阳性，质控组检测结果全为阴性时，检测结果为阳性。
[0016]检测组检测结果为阴性，质控组检测加过全为阴性时，推测为假阴性，重新提取样品DNA进彳丁检测。
[0017]优选地，SI所述处理样品按照SN