一种泰国库蠓的特异基因及其分子鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及物种鉴定领域，具体设及泰国库朦的特异基因序列及其分子鉴定方 法。
【背景技术】
[0002] 库朦是我国Ξ大吸血朦之一，可传播蓝舌病、住球虫病等多种人兽共患病，是一种 重要的病媒生物。因此，对吸血朦的鉴定和识别，是监测与控制朦传疾病发生的基础，也是 疾病预防控制领域的核屯、步骤。目前，对吸血朦的鉴定主要依靠经验丰富的分类学专家识 别形态学特征来实现，一旦遇到近缘种和形态特征掌握不全的标本鉴定就很棘手;而且，对 吸血朦的形态鉴定需要通过制作玻片标本来完成，操作步骤繁琐、周期长、难度大，因此，亟 需寻求一种新的方法，W弥补传统分类方法的缺陷。
[0003] 分子鉴定技术是W遗传物质DNA序列分析为依据来阐明物种间的差别，从分子水 平上快速而准确地鉴别物种。它是分子生物学、计算机科学与传统分类学相结合的产物，作 为一种崭新的分类学技术，极大弥补了传统形态学鉴定的缺陷，已引起越来越多生物学家 们的重视。近年来，随着W PCR基础的DNA序列测定方法的建立和广泛使用，核糖体DNA (rDNA)和线粒体DNA(mtDNA)等基因逐渐受到重视，并在吸血朦的分子鉴定中得到广泛应 用。该技术与传统的分类方法互为佐证，不仅可解决鉴定中标本残缺不全等问题，而且可实 现吸血朦的快速鉴定。本发明提供的泰国库朦特异基因序列有利于实现泰国库朦的快速鉴 定，缩短鉴定时间。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种泰国库朦的特异基因序列及其分子鉴定方法。通过分 子生物学方法获取泰国库朦(化licoides inthanonensis)特异基因一16S rDNA基因序列， 通过基因序列相似性的比对，可准确、快速地鉴定泰国库朦。
[000引为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现： 采用小型昆虫微量DNA模板制备方法，通过改进的PCR反应条件，由合成的引物扩增 泰国库朦的16S rDNA基因，PCR产物序列送由专业生物公司测定。测序结果通过手工校对、 序列拼接，并在NCBI中进行Blast相似性捜索，确保所得序列为目标序列。本发明所述的 泰国库朦特异基因，为16S rDNA基因，所述库朦的16S rDNA基因序列如SEQ ID No. 1所示 (不含引物）：
[0006] 本发明所述的泰国库朦16S rDNA基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为： 正向引物 5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3' 反向引物 5'CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'。
[0007] 本发明所述的泰国库朦的分子鉴定方法，包括： 1) 从待测的昆虫组织中分离提取DNA; 2) m亥DNA为模板，采用的引物为:正向引物5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3'，反向引物5' CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'，通过聚合酶链式反应扩增出该昆虫的16S rDNA基因； 3) 然后取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的16S rDNA基因用琼脂糖电泳分离，经 漠乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果。若能相应地特异性扩增出 大小约为511 bp的条带，送生物公司测序； 4) 根据测序结果，若目标基因序列与SEQ ID No.1的相似性在98%W上，即可判断所述 的待测组织为泰国库朦。
[0008] 泰国库朦的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，并经权威专家复核，从而保证了结 果的可靠性。
[0009] 所述引物根据文献合成，正向引物5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3'，反向引物5' CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'。
[0010] 本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。
[00·Μ]本发明的优点为： 1)本发明采用传统的形态学鉴定与分子分类方法相结合，对所述库朦进行鉴定，可确 保物种鉴定的准确性和可靠性。
[0012] 2)与传统的形态学鉴定方法相比，本发明建立的泰国库朦分子鉴定方法可有效缩 短泰国库朦的鉴定时间。
【附图说明】
[001引图1为泰国库朦16S rDNA基因 PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下:泳道访阴 性对照，泳道2-4为泰国库朦雌虫的16S rDNA基因，检出大小约为511 bp的条带。Μ为化 2000的DNA marker。
[0014]图2为未知库朦雌虫16S rDNA基因 PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1 为阴性对照，泳道2-3为未知库朦雌虫的16S rDNA基因，检出大小约为511 bp的条带。Μ为化 2000的DNA marker。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1泰国库朦(Qilicoides inthanonensis)16S rDNA基因序列的获取 1、泰国库朦标本的获取 泰国库朦为野外采集获得的标本，经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。标本制成玻片 后经权威专家鉴定，确保鉴定结果的准确性。标本制作前，挑取泰国库朦胸部末端和腹部前 几节置于95%酒精中，供DNA提取。
[0016] 2、DNA模板制备 采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取泰国库朦DNA(文礼章主编.昆虫学研究方法 与技术导论[M].北京:科学出版社，2010. PP278-286)，提取的DNA样品保存于-20°C备用。
[0017] 3、引物合成 本实施例所用引物如下： 正向引物 5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3' 反向引物 5'CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'。
[0018] 4、PCR 扩增 本实施例的PCR反应体系如表1所示。
[0019] 表1泰国库朦16S rDNA基因 PCR反应体系巧OuL体系）
本实施例的反应程序如表2所示。
[0020] 表2泰国库朦16S rDNA基因 PCR反应程序
PCR产物于4°C保存备用。
[0021 ] 5、PCR扩增产物检测 取扣L PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min)。漠乙锭染色，凝胶 成像系统检测，电泳图谱参见附图1。
[0022] 6、基因序列测定 选取3-5个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序(测序所用引物与PCR所 用引物相同），所得基因序列经校正拼接后即为泰国库朦的16S rDNA基因序列一SEQ ID No.l。
[0023] 实施例2未知库朦的鉴定 1、标本的采集与保存 采用挥网法或灯诱法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。
[0024] 2、DNA模板制备 在解剖镜或体视显微镜下，从采集到的朦类标本中随机挑出一只雌性库朦，采用小型 昆虫微量DNA模板制备方法提取库朦DNA(文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M].北 京:科学出版社，2010. PP278-286)，提取的DNA样品于-20°C保存备用，每份标本一个编号。
[0025] 3、目的基因序列的获取 3.1引物合成 W获得的未知库朦DNA为模板，合成引物，所用引物序列如下： 正向引物 5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3' 反向引物 5'CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'。
[0026] 3.2 PCR扩增 本实施例的PCR反应体系如表3所示。
[0027] 表3未知库朦16S rDNA基因 PCR反应体系巧OuL体系)_
本实施例的反应程序如表4所示。
[002引 表4未知库朦16S rDNA基因 PCR反应程序_
PCR产物于4°C保存备用。
[0029] 3.3 PCR扩增产物检测与基因序列测定 取扣L PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min)。漠化乙锭染色。凝 胶成像系统检测，电泳图谱参见附图2。由附图2看出实施例2的未知库朦也能特异性扩增出 大小约为511 bp的产物，将大小约为511 bp的产物送生物公司测序，结果显示与基因序 列SEQ ID NO. 1的相似性为99.9%，因而可判定该未知库朦为泰国库朦。
【主权项】
1. 一种泰国库朦特异基因，其特征在于，所述基因为16S rDNA基因，为如下所述的基因 序列沈Q ID No. 1:2. 权利要求1所述的库朦的16S rDNA基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列分别为： 正向引物 5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3' 反向引物 5'CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'。3. -种泰国库朦的分子鉴定方法，包括： 1) 从待测的昆虫组织中分离提取DNA; 2. W该DNA为模板，对16S rDNA基因采用的引物为：正向引物5'GCCTGTTTATCAAAAACAT 3' '，反向引物5'CCGGTCTGAACTCAGATCA 3'，通过聚合酶链式反应扩增出泰国库朦16S rDNA 基因； 3) 然后取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的16S rDNA基因用琼脂糖电泳分离，经 漠乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出大小 约为511 bp的条带，送生物公司测序； 4) 根据测序结果，如果相应16S rDNA基因序列与SEQ ID No.l的相似性在98%W上，即 可判断所述的待测组织为泰国库朦。
【专利摘要】本发明公开<b>一种泰国库蠓的特异基因及其分子鉴定方法，</b>其特征在于采用分子生物学方法获取该库蠓的16S？rDNA基因序列，通过基因序列相似性的比对，对该库蠓进行种类鉴定。本发明提供的泰国库蠓分子鉴定方法，有利于实现泰国库蠓准确、快速的鉴定。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105543364
【申请号】CN201610012014
【发明人】黄恩炯, 陈敏, 杨美琼, 张建明, 高博, 张建庆, 王飞鹏
【申请人】福建国际旅行卫生保健中心
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月8日