赭曲霉毒素a的快速检测方法

文档序号:9780850阅读:721来源:国知局
赭曲霉毒素a的快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米生物传感以及生物检测领域,具体地说,是提供一种赭曲霉毒素A的快速检测方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]赭曲霉毒素包括7种结构类似的化合物,结构通式:Rl=Cl或H; R2=H、CH3或C2H5。其中赭曲霉毒素A(R1=C1,R2=H)毒性最大,在霉变谷物、饲料等最常见。
[0003]赭曲霉毒素A是曲霉和青霉等真菌产生的,广泛污染小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等粮食,也污染花生、蔬菜(豆类)。动物摄入了霉变的饲料后,这种毒素就可能出现在其肉中。人类就会直接或间接地攫入赭曲霉毒素。赭曲霉毒素主要损害肝脏与肾脏,也能引起肠黏膜炎症和坏死,并有致畸作用。因此对赭曲霉毒素A的检测是十分必要的。
[0004]目前,对赭曲霉毒素A检测方法主要是色谱技术,包括薄层色谱(TLC),气相色谱(GC),高效液相色谱(HPLC),液相色谱-质谱联用(LC-MS)等。近年来,发展了基于核酸适体的真菌毒素新的检测方法。如B1sensors and B1electronics 57(2014)226-231 公开了一种用于赭曲霉毒素A的检测的基于DNA骨架的银纳米簇的荧光适体传感器(AFluorescent Aptasensor based on DNA—scaffolded Silver-nanocluster forOchratoxin A Detect1n)。
[0005]中国专利CN102830113B公开了一种目标诱导链释放和限制性内切酶酶切循环的信号放大技术在赭曲霉素A超灵敏度检测中的应用。
[0006]中国专利CN102517288A公开了一种赭曲霉毒素A核酸适体及其应用,该核酸适体可以用于赭曲霉毒素A的检测分析和分离富集。
[0007]通常,色谱法用于食品中痕量真菌检测存在灵敏度不够的问题,液-质联用法虽然灵敏度高、快速,但设备昂贵、应具有专门操作技术人员才能进行检测,技术要求高,不宜大众化和普及,而文献所述的基于核酸适体检测赭曲霉真菌毒素方法或存需要用到价格昂贵的经标记(生物材料等)的DNA,或操作复杂等不足之处。

【发明内容】

[0008]本发明的目的是针对现有技术中存在的问题,提供一种检赭曲霉毒素A的方法。
[0009]本发明采用的技术方案:一种检赭曲霉毒素A的方法,该方法包括如下步骤:
(A)赭曲霉毒素A核酸适体(Apt)与单链信号探针DNA(ssDNA)杂交,形成杂交链;
(B)将待测样品溶液加入到该杂交链溶液,当待测样品中有赭曲霉毒素A时,杂交链选择性地与赭曲霉毒素A反应释放出单链信号探针ssDNA;
(C)消除杂交链的干扰,利用DNA扩增,使杂交链成双链DNA,然后用核酸外切酶选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸,而单链信号探针ssDNA不水解而保留下来;
(D)利用赭曲霉毒素A核酸适体-赭曲霉毒素A结合体不能诱导铜离子还原成近红外荧光的铜纳米粒子,只有单链信号探针ssDNA能诱导铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子,在铜离子还原检测体系中检测体系荧光强度,从而测定待测样品中的赭曲霉毒素A的含量。
[0010]所述铜离子还原检测体系包括先后添加的铜离子和使铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子的抗坏血酸还原剂。步骤(D)的检测,例如包括依次先后向体系中加入铜离子溶液和抗坏血酸溶液,反应后生成近红外荧光铜纳米粒子。
[0011 ]所述赭曲霉毒素A核酸适体为
5,-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC-3,。
[0012]所述可与赭曲霉毒素A核酸适体杂交的单链信号探针ss D N A为5 ’ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTCCCATGCTCC_3’。
[0013]本发明的检测原理如下:先让Apt与ssDNA杂交;当有赭曲霉毒素A存在时,杂交链与赭曲霉毒素A反应释放出ssDNA;体系中存在Apt- ssDNA (剩余的),Apt_赭曲霉毒素A和ssDNA ^pt-赭曲霉毒素A不能诱导铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子,Apt-赭曲霉毒素A存在对测定无干扰;杂交链可能有干扰;为了消除杂交链的干扰:a.利用DNA扩增,使杂交链成双链DNA,b.用核酸外切酶选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸,而单链信号探针ssDNA不水解而保留下来。此时体系中只留下可诱导生成近红外荧光铜纳米粒子的ssDNA,通过检测体系的荧光强度,以波长为340 nm光为激发光,测定体系荧光发射(520-660 nm)光谱的荧光强度,依据荧光强度与赭曲霉素的量的关系,可以测定赭曲霉毒素A的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰,提高了检测的灵敏度和精度。
[0014]本发明另外提供了一种检测赭曲霉毒素A的试剂盒,其至少包括:赭曲霉毒素A核酸适体、可与赭曲霉毒素A核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、外切酶、铜离子还原检测体系。
[0015]所述的赭曲霉毒素A 核酸适体为 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC-3,。
[0016]所述的单链信号探针 s s D N A 为 5 ’ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTCCCATGCTCC_3’。
[0017]所述DNA扩增体系包括缓冲溶液,缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成、三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液(dNTP)和Phi29 DNA聚合酶。
[0018]所述外切酶为Exo III核酸外切酶。
[0019]所述的铜离子还原检测体系中还原剂为抗坏血酸。
[0020]本发明还提供了一种可用于检测赭曲霉毒素A的赭曲霉毒素A核酸适体,其碱基序列为5 ’ -GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC-3 ’。
[0021 ]本发明的优点
根据本发明的检测方法和试剂盒,消除了背景荧光的干扰,提高了赭曲霉毒素A的检测灵敏度和精度。
【附图说明】
[0022]图1为ssDNA-Ag纳米粒子荧光强度与赭曲霉毒素A的浓度关系。
【具体实施方式】
[0023]实施例1 本发明的检测赭曲霉毒素A的试剂盒至少包括:赭曲霉毒素A核酸适体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、铜离子还原检测体系。所述赭曲霉毒素A核酸适体为5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC-3’。所述的单链信
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