一组用于肠癌早期诊断的ndrg4基因甲基化检测引物和探针及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域。更具体地，设及一组用于肠癌早期诊断的NDRG4基 因甲基化检测引物和探针及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 大肠癌（colorectal cancer，CRC)是临床最常见的恶性肿瘤之一，近些年随着经 济的发展，人们的生活方式尤其是饮食结构的变化，肠癌已经成为我国发病率上升最快的 恶性肿瘤之一，严重威胁着国人的生命和健康。而且，晚期患者预后很差，目前，对肠癌进行 早期诊断早期治疗W提高肠癌的治愈率，降低死亡率，已经成为迫切的需要。
[0003] DNA甲基化常常是肿瘤发生发展过程中的早期事件，因此，特异基因的甲基化可作 为肿瘤早期诊断的分子标志物。NDRG4(N-myc downs化eam-reguiated gene 4)为抑癌基因 NDRG基因家族成员之一，NDRG4基因长32化，由17个外显子及16个内含子组成，大量研究表 明该基因与肿瘤细胞的生长、分化和转移有一定关系，其基因5'端调控区域含有CpG岛，在 结直肠癌发生发展过程中常常被甲基化，NDRG4基因甲基化被认为是结直肠癌的重要生物 学特征(Veerie等）。因此，NDRG4基因是候选肿瘤抑制基因和直肠癌的潜在生物标志物， NDRG4启动子的甲基化可作为生物标志物，用于早期诊断结直肠癌。
[0004] 而对于NDRG4基因甲基化的检测而言，检测敏感性和特异性是尤其至关重要的因 素，对肠癌早期诊断的准确判断具有重要的意义。而检测敏感性和特异性受多方面因素的 影响，因此，对于保证和提高NDRG4基因甲基化检测敏感性和特异性的相关研究，是利用该 基因进行肠癌早期诊断的重点和难点。
【发明内容】
[000引本发明要解决的技术问题是克服现有利用NDRG4基因检测进行肠癌早期诊断技术 的不足和缺陷，提供一种高敏感性、高特异性的NDRG4基因甲基化检测引物和探针，而且检 测样本可使用方便获取处理的粪便样品，非常适用于临床筛查，对肠癌的早期诊断具有重 要的意义。
[0006] 本发明的目的是提供一组用于肠癌早期诊断的NDRG4基因甲基化检测引物和探针
[0007] 本发明的另一目的是提供一种利用上述引物和探针制备出的NDRG4基因甲基化检 测试剂盒。
[0008] 本发明上述目的通过W下技术方案实现：
[0009] -组用于肠癌早期诊断的NDRG4基因甲基化检测引物和探针，所述引物为NDRG4- 1FP和NDRG4-1RP，其核巧酸序列分别如SEQ ID NO. 1和2所示;所述探针为NDRG4-2Pb，其核 巧酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010] 一种用于肠癌早期诊断的NDRG4基因甲基化检测试剂盒，包含有上述引物NDRG4- 1FP、NDRG4-1RP 和探针 NDRG4-2Pb。
[0011] 进一步地，上述试剂盒还包括利用引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探针NDRG4-2饥进 行PCR扩增时，获得PC財莫板所需试剂，所需试剂包括提取待测样品DNA时捕获目的片段的捕 获探针NDRG4-CP，捕获探针NDRG4-CP的核巧酸序列如SEQIDN0.4所示。
[0012] 优选地，上述引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探针NDRG4-2Pb的使用浓度均为50~ 500μΜ。
[0013] 更优选地，上述引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探针NDRG4-2饥的使用浓度均为100μ Μ。
[0014] 进一步优选地，上述检测试剂盒还包括利用引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探针 NDRG4-2Pb进行PCR扩增时，PCR扩增体系试剂，包括dNTP、儀离子、反应缓冲液(buf f er)、酶、 无核酸酶的水。
[001引优选地，所述体系试剂包括5~20mM的dNTP、10~40mM的儀离子、1 X~10 X反应缓 冲液、酶、无核酸酶的水。
[0016] 更优选地，所述体系试剂包括5~15mM的dNTP、15~35mM的儀离子、1 X~10 X反应 缓冲液、酶、无核酸酶的水。
[0017] 最优选地，所述体系试剂包括lOmM的dNTP、25mM的儀离子、5 X反应缓冲液（5 X buf f er)、酶、无核酸酶的水。
[0018] 优选地，利用上述试剂盒进行NDRG4基因甲基化检测时，PCR体系中各组分的反应 终浓度如下： 正向引物 0.1~2μΜ
[0019] 反向引物 0，1~2μΜ 賴针 0.1~ΙμΜ dNTP 0.1 ~2miVI 儀离子 2~lOmM:
[0020] 反应缓冲液 lx反应体系总体积 酶 Ο,?υ~0.61巧疋 无核酸酶的水 1X反应体系总体积。
[0021]更优选地，利用上述试剂盒进行NDRG4基因甲基化检测时，PCR体系按照如下比例 进行： 100μΜ的正向引物 0.125yL 100μΜ的反向引物 0.125yL 100μΜ ?向探针 0.05p.L lOmM 的 dNTP l^iL
[0022] 25mM 的儀离子 5μ1^ 5x反应議沖液（5冲u游r) 5阵 廳 〇.5.止 无核酸酶的水 8.2yL 待娜：DNA 5μΙ。
[0023] 更优选地，所述酶为热启动聚合酶。如Promega公司的'Gotaq?).热启动酶或者SIGMA 公司的.1 unipUiq果热启动酶。
[0024] 另外，优选地，利用上述试剂盒进行NDRG4基因甲基化检测时，PCR程序如下：
[00 巧]95°C300s;l 个循环；
[0026] 95°C20s，62°C30s，70°C30s; 10 个循环；
[0027] 95°C20s，58°C60s，72°C30s; 30 ~40 个循环；
[002引 37°C30s;l 个循环。
[0029] 更优选地，利用上述试剂盒进行NDRG4基因甲基化检测时，PCR程序如下：
[0030] 95°C300s;l 个循环；
[0031 ] 95°C20s，62°C30s，70°C30s; 10 个循环；
[0032] 95°C20s，58°C60s，72°C30s; 35 ~40 个循环；
[0033] 37°C30s;l 个循环。
[0034] 另外，优选地，上述待测样品为粪便，上述试剂盒还包括粪便预处理试剂，预处理 试剂为研磨缓冲液。
[0035] 进一步优选地，所述研磨缓冲液具体为:无核酸酶的水、生理盐水、TE、或PBS中的 一种或多种。
[0036] 本发明上述引物和探针及其试剂盒在肠癌的早期诊断方面具有很好的应用前景。
[0037] 本发明具有W下有益效果：
[0038] 本发明针对肠癌的早期诊断，设计获得了一组对NDRG4基因甲基化检测效果非常 好的引物和探针，并且利用上述引物和探针，成功构建了一套NDRG4基因甲基化检测体系和 程序，并组建成试剂盒，对于NDRG4基因甲基化的检测，具有高敏感性和特异性，能够准确特 异诊断早期肠癌，对肠癌的早期诊断和筛查具有重要的意义和应用前景。
[0039] 另外，本发明上述的引物、探针及检测试剂盒，可W使用粪便作为样本，样本处理 简单、易取，并且检测方法为普通PCR法，操作简便、快速，只需75~90min左右的时间即可完 成检测，无需高昂的仪器和检测费用，非常适用于大量样品的检测W及基层筛查。
【附图说明】
[0040] 图1为引物组NDRG4-0FP/NDRG4-0RP的扩增结果。
[0041 ] 图2为引物组NDRG4-1FP/NDRG4-1RP的扩增结果。
[0042] 图3为引物组NDRG4-2FP/NDRG4-2RP的扩增结果。
[0043] 图4为引物组NDRG4-3FP/NDRG4-3RP的扩增结果。
[0044] 图5为引物组NDRG4-4FP/NDRG4-4RP的扩增结果。
[004引图6为探针NDRG4-lPb的扩增结果。
[0046] 图7为探针NDRG4-2Pb的扩增结果。
[0047] 图8为探针NDRG4-3Pb的扩增结果。
[0048] 图9为粪便样品的检测结果。
【具体实施方式】
[0049] W下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。
[0050] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0051] 实施例1引物探针设计
[0052] 1、针对NDRG4基因甲基化的检测，设计了大量引物，经过筛选后获得如下表1所示5 组引物。
[0053] 表1引物序列
[0054]
[00巧]2、探针设计
[0056] 针对NDRG4基因甲基化的检测，设计了大量探针，经过筛选后获得如下表2所示3条 探针。
[0057] 表 2 [005引
[0059] 实施例2样品检测方法
[0060] 1、样本处理和DNA提取：
[0061] (1)粪便样本和缓冲液按照Ig粪便:4ml缓冲液的比例混合研磨后，离屯、留取上清 液，丢弃沉淀物。