一种用于早期筛检大肠癌相关igf2基因甲基化表型的引物、试剂盒及其应用

文档序号:9780853阅读:2125来源:国知局
一种用于早期筛检大肠癌相关igf2基因甲基化表型的引物、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于筛检人大肠癌的引物及试剂盒,特别设及一种基于人外周血 白细胞DNA水平的用于早期筛检人大肠癌的特异性甲基化检测引物、试剂盒及其应用,属于 疾病的早期筛检与防治领域。
【背景技术】
[0002] 大肠癌(CO lorec tal cancer,CRC )是常见的消化道恶性肿瘤之一。据 GL0B0CAN2012统计,2012年全球约有136万大肠癌新发病例,其发病率在男性肿瘤中居第Ξ 位,在女性肿瘤中高居第二位。近年来,我国大肠癌的发病率呈逐年上升的趋势化ttp:// globocan. iarc.打/Pages^act_sheets_cance;r.aspx)。据统计,2013年全球约有69万大肠 癌死亡病例。不过其死亡率在西方发达国家的大肠癌死亡率有明显的下降趋势,究其原因, 与早期筛检,早期诊断及早治疗密切相关。虽然大肠癌的死亡率在全球范围内呈下降趋势, 但发展中国家大肠癌的死亡率却有逐年上升趋势。因此,如何提高我国大肠癌早期筛检早 期诊断的水平,降低发病率和死亡率,提高生存率已是我国大肠癌防治研究工作的重点。
[0003] 大肠癌的形成是多因素作用、多基因参与、多阶段、多步骤的过程,是遗传因素与 环境因素交互作用的结果。表观遗传学改变的长期累积是导致大肠癌发生或者加速大肠癌 发展的重要分子生物学基础。然而,目前发表的绝大多数大肠癌相关甲基化研究往往关注 于肿瘤组织学水平,而针对于外周血白细胞DNA水平的基因甲基化与大肠癌易感性的研究, 并基于此进行大肠癌风险预测W鉴定大肠癌高危人群过的研究也才刚刚起步。
[0004] 最近一些研究证实,基于人外周血白细胞DNA水平的基因甲基化是一种可检测的 灵敏的肿瘤相关的标记物。与肿瘤组织DNA甲基化检测相比,外周血样本在临床实践中更容 易获得且几乎无创更容易被研究对象接受。综上所有证据提示我们,人外周血白细胞基因 甲基化表型的研究可能正好为我们理解运一关系提供了一种更为可行更易被受试者接受 的路径。因此,进一步筛选、验证有应用价值的人外周血白细胞基因甲基化作为大肠癌早期 分子标志物,探索并建立新的大肠癌早期筛检技术,能够早期、灵敏并稳定地筛检大肠癌高 危人群,W便及早采取措施进行早预防,早治疗,可W有效降低医疗成本,节约社会资源。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于人外周血白细胞DNA水平的,用于检 测大肠癌相关IGF2基因甲基化表型的引物及试剂盒,W实现对大肠癌高危人群的早期筛 检。与常规的大肠癌筛检方法相比,本发明的方法具有创伤小、早期、快速、高通量、灵敏度 高W及特异性好等优点,能更好地应用于人大肠癌的早期筛查。
[0006] 本发明的目的主要体现为W下Ξ个方面:
[0007] 1.提供一种基于人外周血白细胞DNA水平的大肠癌特异性甲基化检测的MS-HRM引 物,用于人大肠癌的早期基因筛查。
[0008] 2.建立一种人大肠癌的基因甲基化检测技术,W弥补现有筛查技术的不足。
[0009] 3.提供一种用于早期筛查大肠癌高危人群的试剂盒。
[0010] 为了达到上述目的,本发明所采用的技术手段包括:
[0011] 在人大肠癌基因组中IGF2基因启动子区的CpG岛区域设计一对甲基化特异性高分 辨率溶解曲线(MS-HRM)检测的引物;应用该对引物对待测硫化后DNA样本进行RT-PCR和MS- HRM检测,根据MS-HRM结果判定待检样本是否为人大肠癌样本。
[0012] 第一方面,本发明提供了一种基于人外周血白细胞DNA水平的,用于早期筛检人大 肠癌相关IGF2基因甲基化表型的引物,所述引物由正向引物和反向引物组成,引物序列如 下:
[0013] 正向引物:5-GGGATTTGGTTGAGGTTTTAAG-3(SEQ ID N0.1)
[0014] 反向引物:5-TACGACTAAAAAAACCCCTAAACTC-3(沈Q ID N0.2)
[0015] 第二方面,本发明提供了一种基于人外周血白细胞DNA水平的,用于早期筛检人大 肠癌的相关IGF2基因甲基化表型的试剂盒,包括W上所述的用于早期筛检人大肠癌相关 IGF2基因甲基化表型的引物。
[0016] 在本发明所述的试剂盒中,优选的,所述的试剂盒中还包括2 XPCR MasterMix, 25mM MgCbW及PCR-grade Water。
[0017] 第Ξ方面,本发明还提供了 W上所述的引物及所述的试剂盒在制备早期筛检人大 肠癌试剂中的应用。
[0018] 第四方面,本发明还提供了一种利用本发明的MS-HRM甲基化检测引物或试剂盒早 期筛检人大肠癌的方法,包括如下步骤:
[0019] (1)将待检的人外周血白细胞DNA进行硫化修饰处理,取硫化后DNA,作为RT-PCR的 反应模板进行MS-HRM检测;
[0020] (2)在总体积为10微升的RT-PCR反应体系中,加入1~2微升的待测硫化后DNA作为 模板,加入正向引物和反向引物;其他试剂按照常规方法及剂量加入;
[00別](3)进行RT-PCR反应,反应条件为:95°C预变性10分钟;95°C变性10秒,56°C复性30 秒,72°C延伸20秒,采集巧光信号,循环45次;
[0022] (4)进行MS-HRM检测,检测条件为:95°C预变性1分钟;40°C复性1分钟,从60°C梯度 升溫至98°C,并采集巧光信号,40°C复性10分钟;
[0023] (5)对MS-HRM结果进行Tm-Cal ling和Gene-Scanning分析:如果待测样品与阳性标 准品的Tm值相符,且待测样品的甲基化水平大于0.5%,即Cut-Off值取为0.005,结果为阳 性;反之,结果为阴性。
[0024] 在本发明所述的方法中,优选的,硫化后DNA的量至少为20ng/反应。
[0025] 在本发明所述的方法中,优选的,正向引物和反向引物在RT-PCR反应体系中的终 浓度均为〇.4μΜ。
[0026] 在本发明所述的方法中,优选的,步骤(4)中所述的梯度升溫为按照0.1°C/秒的梯 度进行升溫。
[0027] 相较于现有技术,本发明的有益效果体现在:
[0028] (1)灵敏度:本发明的方法可从最低20ng的硫化后DNA中检测到最低0.1%甲基化 水平的甲基化改变,说明具有极高的灵敏度。
[0029] (2)特异性:用本发明的引物和方法检测大肠癌患者的外周血白细胞DNAW及健康 对照的外周血白细胞DNA样本,通过受试者工作特征曲线(R0C)分析发现具有良好的区分 度。运说明本发明有较好的特异性。
[0030] (3)高通量:本方法应用包含HRM分析模块的巧光定量PCR仪,一次可W同时检测88 例样本,具有较高的通量,从而大量地节省了时间,提高了检测效率。
[0031] (4)与常规的大肠癌筛检方法相比,本发明的方法采用的生物样本来自于人外周 血具有创伤性小,适合在普通人群中进行推广应用。
[0032] 综上,本发明的引物和试剂盒具有快速、高通量、灵敏和特异性好等特点,能更好 地进行人大肠癌的早期筛检。
【附图说明】
[0033] 图1为被检测区域示意图;
[0034] 其中,被检测区域的具体位置为chrll:2,125,408-2,125,508;长度为l(Ubp,包含 9个CpG位点;位于IGF2基因的启动子区。
[0035] 图2为人外周血白细胞DNA样本的IGF2基因启动子区的RT-PCR扩增曲线;
[0036] 图3为人外周血白细胞DNA样本的IGF2基因启动子区的MS-HRM分析的烙解峰形图;
[0037] 图4为人外周血白细胞DNA样本的IGF2基因启动子区的MS-HRM分析的标准化烙解 曲线图。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施实例,对本发明做进一步地说明,但本发明并不受限于下述实施实 例。
[0039] 实施例1:一种基于人外周血白细胞DNA水平的,用于早期筛检大肠癌相关IGF2基 因甲基化表型的MS-HRM引物的建立
[0040] 本发明的大肠癌甲基化特异的高分辨率溶解曲线检测的引物,是根据NCBI(美国 国立生物技术信息中屯、)公开的人类全基因组序列(Ref seq.AC132217),使用Methprimer Software化ttp://www.urogene.org/methprimer/似及Primer Premier versions.0在人 大肠癌基因组中IGF2基因启动子区的CpG岛区域(图1所示)设计的一对甲基化特异性高分 辨率溶解曲线(MS-HRM)检测的引物,由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成,所述引物的序 列如下所示:
[0041] 正向引物:5-GGGATTTGGTTGAGGTTTTAAG-3(SEQ ID N0.1)
[0042] 反向引物:5-TACGACTAAAAAAACCCCTAAACTC-3(沈Q ID N0.2)
[0043] 实施例2:-种基于人外周血白细胞DNA水平的,用于早期筛检大肠癌相关IGF2基 因甲基化表型的MS-HRM检测试剂盒
[0044] 包括W下引物序列:
[0045] 正向引物:5-GGGATTTGGTTGAGGTTTTAAG-3(SEQ ID N0.1)
[0046] 反向引物:5-TACGACTAAAAAAACCCCTAAACTC-3(沈Q ID N0.2)
[0047] 所述的试剂盒中还包括2XPCR MasterMix,25mM MgCbW及PCR-grade Water。
[0048] 实施例3:本发明的试剂盒在早期筛检人大肠癌中的应用
[0049] 本发明采用的分析试剂盒为Li曲t切cler 480Hi曲Resolution Melting Master Mix(Roche,Mannheim,Germany) ;DNA提取试剂盒为,QIAamp Blood DM Mini Kit(Qiagen, Hilden,Germany);硫化试剂盒为,EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(Qiagen,Hilden, Germany);实验采用的甲基化标准品为,Human WGA Methylated&Non-methylated DM Set (Zymo Research,Orange,CA,USA);其他试剂为国产分析纯试剂。
[0050] 本发明所采用的生物材料均来自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院结直肠外科,所有 生物学样本的采集及试用均经由患者本人同意并签署知情同意书及伦理证明后采集。
[0051] 方法;
[0化2] -、人外周血白细胞DNA提取流程(DNA提取试剂盒为QIAamp
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