一种用于夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定的ssr引物ssr81及鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于杂交种子纯度鉴定技术领域，具体设及一种用于夏冠一号节瓜杂交种 子纯度鉴定的SSR引物SSR81及鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 种子是重要的农业生产资料，种子质量优劣直接影响农业生产效果。种子纯度是 衡量种子质量的重要指标，建立可靠、便捷的种子纯度检测方式，对于准确快速评价种子质 量，保证种子生产者、销售者和使用者的利益具有重要意义。
[0003] "夏冠一号"节瓜是广东省农业科学院蔬菜研究所选育杂交一代节瓜品种。其杂交 种生产过程中，父母本自交系按照一定比例分行种植，并与其他品种或者类型的节瓜、冬瓜 保持1000MW上的隔离距离;母本植株开花前要去除母本上所有雄花，并利用昆虫等传粉媒 介或者人工辅助授粉的方式，取父本雄花对母本雌花进行杂交授粉，获得杂交种子。造成杂 交种子不纯的原因可能有:制种时母本田间去雄不及时或不彻底，从而造成母本自交导致 的生物学混杂；田间没有做好隔离措施使其他品种的花粉混入导致的生物学混杂;收获前 父本没有及时拔出或收获后惊晒加工时其他品种混入造成的机械混杂。因此在进行杂交种 子销售前必须进行纯度鉴定，鉴定结果符合国家对杂交种子纯度标准的方能出售给客户。
[0004] 随着分子生物学的发展，分子标记法在杂交种种子纯度鉴定中应用越来越广泛， 并逐渐替代了鉴定周期长、鉴定结果易受环境影响的传统的形态鉴定法、物理化学鉴定法、 生化标记鉴定法等。分子标记包括AFLP(扩增片段长度多态性)标记、RAPD(随机引物扩增多 态性)标记、SRAP(相关序列扩增多态性)标记、RFLP(限制性片段长度多态性)标记等，其中 SSR标记呈共显性遗传，且多态性丰富，重复性好，结果稳定可靠，且所需DNA样品量少，提取 方法简便，是目前广泛应用的分子标记技术。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的在于提供一种用于夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引 物SSR81，该引物能产生母本特异性标记和父本特异性标记（即共显性标记），重复性好、特 异性强。
[0006] 本发明的目的还在于提供一种夏冠一号节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，该方法利 用上述SSR引物，能准确、快速、便捷、有效的鉴定夏冠一号节瓜杂交种子纯度。
[0007] 本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种用于夏冠一号节瓜杂交 种子纯度鉴定的SSR引物SSR81，所述引物SSR81包括上游引物SSR81-F和下游引物SSR81-R， 所述上游引物SSR81-F的核巧酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述下游引物SSR81-R的核巧酸 序列如沈Q ID NO.2所示。
[000引引物SSR81的上游引物SSR81-F和下游引物SSR81-R的具体核巧酸序列分别如下： [0009] SSR81-F:5'-GACAGAATTGGGGGTTTGTG-3'（沈Q ID N0.1);
[0010] SSR81-R:5'-TCAACAGCAGTTGGTGGAAG-3'（沈Q ID N0.2)。
[ocm]运组引物SSR81标记带型清晰、重复性好，经特异性片段(聚丙締酷胺非变性胶）回 收DNA-PCR扩增一琼脂糖胶回收一TA克隆测序后，分析结果得知：引物SSR81能产生18化P 的母本特异性标记SSR81181W及188bp的父本特异性标记SSR81188。
[0012] 本发明的第二个目的是通过W下技术方案来实现的：一种夏冠一号节瓜杂交种子 纯度的鉴定方法，包括W下步骤：
[0013] (1)提取节瓜子叶的基因组DNA;
[0014] (2)W节瓜子叶的基因组DNA为模板，采用上述引物SSR81进行PCR扩增；
[0015] (3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳；
[0016] (4)对凝胶电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的 杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，其中引物SSR81能产生18化P的母本特异性标 记SSRSlmW及188bp的父本特异性标记SSR81188,根据凝胶电泳结果，计算种子纯度。
[0017] 在上述夏冠一号节瓜杂交种子纯度的鉴定方法中：
[001引步骤(2)中PCR扩增时，20化的反应体系包括：1山农度为150ng · μ1/?的节瓜子叶的 基因组DNA，化L含Mg2 +的10 X PCR buf f er，1.5化的浓度为2.5mM的dNTPs，1化浓度为 0.25mmol · [1的上游引物551?81斗，化1浓度为0.25mmol · L-1的下游引物SSR81-RayL Taq 酶，12.化1 dd出0。
[0019] 步骤(2)中PCR扩增时的扩增程序为:95°C预变性3min后，94°C变性45 s，68°C退火 Imin，72°C延伸Imin，6个循环，其中退火溫度每个循环降2°C; 94°C变性30s，58°C退火Imin， 72°C延伸Imin，8个循环，其中退火溫度每个循环降rc; 94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延 伸Imin，30个循环后，72°C终延伸7min，4°C保存。
[0020] 步骤(3)中凝胶电泳采用质量百分含量为8%的非变性聚丙締酷胺凝胶电泳。
[0021 ]与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0022] (1)本发明中的SSR引物SSR81在杂种一代中能同时产生母本特异性标记和父本特 异性标记，且特异性强；
[0023] (2)本发明的方法可将"夏冠一号"节瓜杂交种子与其亲本区分开来，快速检测出 杂交种子的纯度；
[0024] (3)本发明方法具有准确、快速、成本低、鉴定周期短操作简便等优点，能够代替传 统杂交种子纯度鉴定的方法，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0025] 图1是实施例1中夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定中引物SSR81的PCR产物的聚丙 締酷胺凝胶电泳图谱，其中M:l(K)bp Ladder I分子量标准;Pi:母本(夏冠母本），P2:父本(夏 冠父本）；Fi:商品种夏冠一号；
[0026] 图2为实施例3中从遂溪所取第1-46个商品种"夏冠一号"样品单株，圆圈代表与母 本带型一致的假杂种；
[0027] 图3为实施例3中从遂溪所取第47-92个商品种"夏冠一号"样品单株，圆圈代表与 母本带型一致的假杂种；
[0028] 图4为实施例3中从遂溪所取第93-108个商品种"夏冠一号"样品单株，圆圈代表与 母本带型一致的假杂种；
[0029] 图5为实施例3中从遂溪所取第139-169个商品种"夏冠一号"样品单株，圆圈代表 与母本带型一致的假杂种；
[0030] 图6为实施例3中从遂溪所取第170-189个商品种"夏冠一号"样品单株，圆圈代表 与母本带型一致的假杂种；
[0031] 图7为实施例3中从遂溪所取第190-230个商品种"夏冠一号"样品单株，圆圈代表 与母本带型一致的假杂种；
[0032] 图8为实施例3中从遂溪所取第231-276个商品种"夏冠一号"样品单株，圆圈代表 与母本带型一致的假杂种；
[0033] 图9为实施例3中从遂溪所取第277-294个商品种"夏冠一号"样品单株，圆圈代表 与母本带型一致的假杂种。
【具体实施方式】
[0034] 实施例1
[0035] 本实施例提供的用于夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物SSR81的筛选过 程如下：
[0036] 根据冬瓜转录组测序结果设计的引物若干对在亲本(夏冠一号父本，夏冠一号母 本)及F1(夏冠一号杂交种）间进行筛选，选出共显