检测乳腺癌her2基因的纳米量子点标记分子探针及其制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及生物医学领域，具体地说，设及一种检测乳腺癌皿R2基因的纳米量子 点标记分子探针及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，据世界卫生组织国际癌症研究中屯、统 计，2012年全球女性乳腺癌新发病例达167万，占全部女性肿瘤发病的25.2% ;52万女性因 乳腺癌死亡，占所有女性恶性肿瘤死亡的14.7 %。在我国，乳腺癌占据女性恶性肿瘤发病的 首位，2009年调查结果显示其标化发病率为23.16/100,000,显著高于其它癌症的发病率， 并W每年2-3%的增长速率递增。同时，我国女性乳腺癌的死亡率呈连续上升趋势，达4.94/ 100，000，是女性第五位最常见的恶性肿瘤死亡原因。
[0003] 人类表皮生长因子受体化uman 邱idermal growth factor receptor,肥R/IirbB) 家族属酪氨酸激酶受体，包括4种同源跨膜蛋白：肥RUEG-FR或化bBl)、皿R2(Neu或化bB2)、 肥R3化rbB3)和肥R4化rbB4)。每种受体蛋白酪氨酸激酶活性域高度保守，使其结构和功能 具有很高的同源性并成为受体间相互作用及交叉激活的分子基础。皿R1、皿R3或肥R4与配 体结合后，通过与肥R2形成异二聚体而激活其细胞膜内侧含有酪氨酸残基的蛋白片段，使C 末端的酪氨酸激酶发生憐酸化，信号通路被激活，进而参与多种细胞功能的调节，如生长、 增殖和调亡等。人类肥R2基因是定位于17号染色体的原癌基因，皿R2蛋白膜内段的各酪氨 酸残基发生憐酸化后均能作用于特定的信号蛋白，激活信号转导通路。运些信号转导通路 包括Ras/促分裂原活化蛋白激酶通路、PI3K/AKT/mT0R通路、Janus激酶/信号转导蛋白和转 录激活因子通路及化C-丫通路。转导途径的异常和各种肿瘤，尤其是乳腺癌的生长及增殖 密切相关。临床上约20 %的乳腺癌患者存在肥R2基因扩增或过表达。有数据显示，皿R2的过 表达预示着疾病复发及患者存活率的降低。
[0004] 作为21世纪最重要的高新技术之一，纳米技术在癌症诊疗方面已展示出广阔的应 用前景。特别是纳米巧光量子点（Quantum dots,Cff)s)，作为一种半径小于或接近于激子玻 尔半径的新型半导体纳米晶粒，表现出独特的量子尺寸和表面效应，使其具有W下多方面 优越的光学特性:巧光发射波长可控、发射峰狭窄对称，激发谱宽而连续，消光系数大、巧光 强度高、光稳定性好。经过表面修饰及功能化后，量子点易与生物功能分子禪联，成为量子 点标记探针，在分子成像中与传统的免疫巧光标记探针相比具有显著应用优势，主要表现 在：1)实现分子信息的高准确性及灵敏性定量检测:量子点的巧光强度高、耐光漂性强，能 克服生物组织自发巧光的影响，获得准确的成像信息并进行量化;2)长时间、实时成像:巧 光强度高、抗光漂白能力强，及经过适当修饰后具有良好的生物相容性，能够耐受复杂的生 物医学应用环境，可用于长时间、实时分子成像研究；3)多分子共成像与相互作用研究：不 同材料或大小的量子点可具有不同的发射光谱，可实现多个分子的原位、实时、同时成像； 4)深组织成像:巧光发射波长可控使其可发射近红外波长的光谱，具有较好的组织穿透性， 对体内成像监测十分理想。
[0005] 近年来，基于量子点标记探针技术的分子成像、细胞成像和在体成像取得了重要 进展。目前，量子点标记探针技术的研究重点已从基础研究向转化应用研究转变，将量子点 标记探针技术用于肿瘤学研究，通过对肿瘤演变进展过程的关键分子事件、关键细胞事件 进行实时、高灵敏、长时间标记成像，有望对肿瘤发病机制研究、早期诊断、祀向治疗、预后 复发监测等方面产生重要影响。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种检测乳腺癌皿R2基因的纳米量子点标记分子探针及其 制备方法。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的用于检测乳腺癌皿R2基因的纳米量子点标记分子 探针，所述分子探针包含:识别单元、连接单元和信号报告单元；
[000引所述识别单元为经过表面修饰的水溶性化S包被的CdSe量子点与生物素标记的高 特异性核巧酸序列；
[0009] 所述连接单元为利用量子点表面的元素如Zn、Cd等与琉基之间强的络合作用力， 使量子点与琉基酸络合带上簇基，琉基酸可W是琉基乙酸、琉基丙酸、琉基下二酸、6,8-二 琉基辛酸等；
[0010] 所述信号报告单元为:biotin与STV/avidin/ExtrAvidin连接形成的；
[0011] 所述分子探针的通式如下：
[0012] QDs-高特异性核巧酸序列-biotin-STV/avidin/ExtrAvidin;
[0013] 其中，QDs为水溶性化S包被的CdSe量子点，其巧光发射波长在520皿-620nm;所述 生物分子是指可与乳腺癌肥R2基因相互作用的核酸、多肤、抗体或小分子抑制剂。
[0014] 所述经过表面修饰的水溶性ZnS包被的CdSe量子点是指在水溶性ZnS包被的CdSe 量子点表面修饰可与生物分子连接的官能团。例如，表面带-C00H或-NH2的量子点很容易进 行PEG、NTA、Biotin或化late等功能化，所得产物具有更好的生物相容性和更广泛的适应 性。
[0015] 优选地，所述生物分子是指可与SEQ ID NO: 1所示序列杂交的DNA片段。
[0016] 更优选地，所述分子探针为QDs-DNA-biotin-STV。
[0017] 本发明还提供一种用于检测乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒中含有上述分子探针。
[0018] 本发明进一步提供分子探针QDs-DNA-biotin-STV的制备方法，包括W下步骤：
[0019] 1)水溶性ZnS包被的CdSe量子点的制备；
[0020] 2)水溶性aiS包被的CdSe量子点与biotin标记的DNA连接，制备QDs-DNA-biotin;
[0021] 3)STV 与 QDs-DNA-biotin 结合，制备 QDs-DNA-biotin-STV。
[0022] 步骤1)具体为：
[0023] 取12.5g Τ0Ρ0(Ξ辛基氧化麟)置于反应瓶中，于200°C真空环境下干燥并脱气约 20min;然后升溫到350°C接近一个大气压，待溫度稳定后，将0.7ml储存液A加入反应瓶中并 停止加热；待反应混合液冷却至310°C，析出少量的CdSe纳米晶体；当溫度降至300°C，将储 存液B按每次0.55ml的量加入反应瓶中，间隔20s加入一次，共加入5次(储存液A、储存液B的 摩尔比约为1:4)，待溫度降至100°C，恒溫揽拌反应化，然后，将无水甲醇加入到上述反应液 中，离屯、收集沉淀，向沉淀中加入无水甲醇清洗，然后离屯、收集沉淀，沉淀用无水甲醇重复 清洗2次，W去除残余的TOPO;将收集的纳米晶体悬浮于10ml氯仿中，离屯、去除残余碎片和 尚未反应的试剂;通过吸收光谱峰、X射线或测量直径等方法筛选出巧光发射波长在520nm- 62化m且粒径均一，单分散性好的化S包被的CdSe纳米粒子;然后将其完全溶于氯仿中，超声 30min，向其中逐滴加入蒸馈水至50ml。滴加完毕，将混合液旋蒸除去氯仿，使用.022um滤膜 过滤水溶液，得到透明的水溶性化S包被的CdSe量子点。
[0024]其中，储存液A的制备方法如下:取0.2g Se溶于4.5ml TOP溶液（lOOuM)，向其中加 入0.25ml MesCd溶液（lOOuM)，再加入19.5ml TOP溶液混匀即得储存液A，保存于充满化的干 燥盒中；
[002引储存液B的制备方法如下：取0.52ml(TMS)2S加入4.5ml TOP溶液中，向其中加入 3.5ml MesZn溶液（lOOuM)，再加入16ml TOP溶液混匀即得储存液B，保存于充满化的干燥盒 中。
[0026] 步骤2)具体为：（备注:该部分包含表面修饰）
[0027] 将1.2nmol Q化与12皿〇1经琉基、biotin双修饰的DNA混合，加入化is缓冲液，最终 形成1 X Tris缓冲液，在25°C恒溫振荡器上震荡后，避光放置过夜，使琉基修饰的DNA分子与