一种利用多个标记基因对梨黑斑病菌进行种级分类的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体地说，设及一种利用多个标记基因对梨黑斑 病菌进行种级分类的方法。
【背景技术】
[0002] 梨黑斑病是由链格抱真菌侵染引起，主要危害果实、叶片及新梢。该病在世界范围 内广泛发生。尤其在亚洲的日本、韩国、中国发病严重。
[0003] 1933年Tanaka首次在日本报道梨黑斑病，并将该病原菌命名为Alternaria kikuchiana Tanaka。由于早在 1920年，Nagano就报道了该菌的学名Alternaria gaisen Nagano,因此，根据命名法，simmon认为A. kikuchiana是A. gaisen的晚出异名。
[0004] 目前世界上报道的从储藏期梨果实上分离的链格抱有9种，在中国报道的有5种， 分風I为Altern曰ri曰邑曰iseruAltern曰ri曰曰Item曰t曰、Altern曰ri曰 tenuissim曰、Altern曰ri曰 y曰liinficiens、Altern曰ri曰.ventricos曰.
[0005] 对于小抱子链格抱，目前种级分类标准是根据分生抱子形态、产抱表型、寄主范围 等依据。ITS只能鉴定到属一级，无法鉴定到种级水平。Simmons和3〇66的3根据产抱表型及 分生抱子形态，将从全国各地采集的亚洲梨上分离的菌株，用代表性的种确定了几个明确 的组，女曰Alternaria 邑aisen组、Alternaria alternata组、Alternaria tenuissima组等。
[0006] 根据Simmons和Robeds的分类方法，GB/T 28072-2011梨黑斑病菌检疫鉴定方法， 对梨黑斑病菌的鉴定主要根据形态学及致病性测定。该标准鉴定的A.gaisen分生抱子梗直 立，不分枝或基本不分枝，多数抱子链含5~9个抱子。分生抱子大小（12.2皿~35. Ομπι) X (5.祉m~14.5皿），瞭呈短柱状或锥状，约（2皿~8.7皿）X (2.3皿~4.6皿），抱子横隔1~4， 纵斜隔膜为0~3。病斑初期圆形或不规则形，后扩大成同屯、环纹状，暗褐色。符合W上特征 的即为A. gai sen。近似种A. al ternata，分生抱子链分枝繁复、致密;A. tenui SS ima，分生抱 子链长，每链10~15个抱子，分枝很少。A. inf ectoria分生抱子链分枝松散，次生抱子梗长。 此Ξ种近似种对梨叶不致病。
[0007] 为了研究田间梨黑斑病菌的种群结构，从田间发病梨叶片及果实上分离得到127 株链格抱真菌。根据产抱表型观察，127株菌株中包括A. gai sen组、A. alternata组W及 A. tenuissima组。致病性测定结果显示:Ξ组菌株对梨叶片及果实均有致病性，但致病力存 在差异。在种级鉴定过程中，发现小抱子种链格抱分生抱子形态具有多态性，且形态特征易 受溫湿度、光照等培养条件的影响；另外来自寄主与来自培养基上的分生抱子形态具有较 大差异;产抱表型相对容易观察，但在实际操作过程中，存在一些过渡性态;还有一类产抱 极少或不产抱的链格抱菌株，均给种级鉴定带来一定困难。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种利用多个标记基因对梨黑 斑病菌进行种级分类的方法，利用多个标记基因综合构建系统发育树，通过聚类分析对梨 黑斑病菌进行种级分类鉴定。通过标记基因筛选比较，WLEU/GPD+HIS综合构建系统发育 树，可准确快速的区分引起梨黑斑病的链格抱种类。该方法从链格抱基因组DNA中寻找合适 的标记基因作为分离依据，是种级鉴定的可靠方法。
[0009] 其具体技术方案为：
[0010] -种利用多个标记基因对梨黑斑病菌进行种级分类的方法，包括W下步骤：
[001。 第一步，WLEU/GPD、HIS特异引物进行PCR扩增，扩增产物连接PUC19载体，挑取单 克隆测序。第二步LEU/GPD、HIS扩增产物序列拼接，第Ξ步，WMEGA5.0对序列进行分析，根 据聚类结果，明确待测菌株的种类。
[001 ^ 优选地，所述特异引物序列分别为:HIS3-巧日SEQ: ID: NO: 1所示，HIS3-喊日SEQ: ID: NO: 2所示，L抓-F如沈Q: ID: NO: 3所示，L抓-R如SEQ: ID: NO: 4所示，GPD-F如SEQ: ID: NO: 5所 示，6?0-喊日沈0:10:備：6所示。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0014] 本发明利用多个标记基因综合构建系统发育树，通过聚类分析对梨黑斑病菌进行 种级分类鉴定。通过标记基因筛选比较，WLEU/GPD+HIS综合构建系统发育树，可准确快速 的区分引起梨黑斑病的链格抱种类。该方法从链格抱基因组DNA中寻找合适的标记基因作 为分离依据，是种级鉴定的可靠方法。
【附图说明】
[001引图1是MEGA5.0进行序列分析结果。
【具体实施方式】
[0016] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合附图和具体实例进一步阐述本发明。
[0017] 1、菌株的分离培养
[0018] 采田间具有典型黑斑病症状的叶片及果实，采用组织分离法分离病原菌。取病斑 与健康组织交界处约0.5cm2大小组织，先在0.3%次氯酸钢溶液中消毒30s，再用75%酒精 消毒30s，然后在清水中漂洗3次，于无菌滤纸上吸干水分后，置于PDA平板上，25°C普通光照 培养箱中培养。
[0019] 2、菌株的单抱(单菌丝)分离
[0020] 待菌落在PDA平板上生长5天后，W 1ml无菌水反复冲洗菌落，取抱子液稀释至一定 浓度后，均匀涂布于2 %水琼脂板上，待培养基表面水分风干后，25°C培养过夜。第2天在显 微镜下挑取已萌发的单抱(若无抱子，可W挑取单根菌丝），置于新的PDA平板上培养。
[0021] 3、柯赫氏法则鉴定
[0022] 将单抱分离的菌株W分生抱子液、菌丝块接种梨叶片和果实，将能产生黑斑病典 型症状的菌株再分离，并保存。
[0023] 4、黑斑病菌DNA的提取
[0024] 将梨黑斑病菌WPDA培养基培养7天后，刮取菌丝约0.5g，W改良CTAB法提取菌丝 DNA。
[0025] 5、PCR 扩增
[00%]分别WHIS、L抓或Gro特异引物进行PCR扩增，引物序列如表1所示：
[0027]表 1 [002引
[0029] 扩增程序如下：95°C5mins; 95°C45s，53°C30s，72°C30s; 35巧cles; 72°C10mins
[0030] 6、连 PUC19 载体
[0031] 扩增产物取扣1电泳检测检测。然后扩增产物与载体PUC195yl混合，WEcoRI、化nd 虹双酶切。酶切30mins后，沉淀回收。PCR产物先加入80μ1无菌水成10化1，然后加入60 %体 积异丙醇10000转离屯、lOmins，弃上清，加入200μ175 %乙醇漂洗，10000转离屯、5mins，弃上 清，超净工作台内惊干后，加8化1无菌水溶解。加入连接酶1 igase 0.化1，连接过夜。
[0032] 7、电击转化
[0033] W大肠杆菌DH 5α进行转化，连接体系与20μ10Η 5α感受态细胞混合均匀后，W 1600V电压，电击，37°C培养箱放置20mins后涂Amp板(加 X-gal)。
[0034] 37°C培养箱12~16个小时候，观察，挑单菌落(不带蓝斑)摇菌，菌液培养8小时后， 送样测序。
[0035] 8、序列分析
[0036] 测序由上海上海百力格生物技术有限公司完成。首先，将各菌株的GPD/LKJ与HIS3 扩增序列拼接，然后WMEGA5.0进行序列分析。分析结果如图显示，链格抱菌可聚为Ξ大类， 分風I为:Altern曰ri曰.曰Item曰t曰、Altern曰ri曰.邑曰isen、、Altern曰ri曰.tenuissim曰。
[0037] W上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明 披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的 保护范围内。
【主权项】
1. 一种利用多个标记基因对梨黑斑病菌进行种级分类的方法，其特征在于，包括以下 步骤： 第一步，以LEU/GPD、HIS特异引物进行PCR扩增，扩增产物连接PUC19载体，挑取单克隆 测序。第二步LEU/GPD、HIS扩增产物序列拼接，第三步，以MEGA5.0对序列进行分析，根据聚 类结果，明确待测菌株的种类。2. 根据权利要求1所述的利用多个标记基因对梨黑斑病菌进行种级分类的方法，其特 征在于，所述特异引物序列分别为:HIS3-F如SEQ :ID:N0:lK*，HIS3-I^nSEQ:ID:N0 :2K 示，LEU-F如 SEQ: ID: NO: 3所示，LEU-R如SEQ: ID: NO: 4所示，GPD-F如SEQ: ID: NO: 5所示，GPD-R 如SEQ: ID:NO:6所示。
【专利摘要】本发明公开了一种利用多个标记基因对梨黑斑病菌进行种级分类的方法，包括以下步骤：(1)利用标记基因LEU/GPD、HIS的特异引物对待测菌株进行PCR扩增；(2)扩增产物连接PUC19-vector，再测序；(3)利用MEGA软件对LEU/GPD+HIS综合序列进行系统分析，从而对不同梨黑斑病菌菌株进行分类。此鉴定方法可准确快速的对梨黑斑病菌进行种分类。
【IPC分类】C12R1/645, C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN105543407
【申请号】CN201610149853
【发明人】朱红艳, 秦仲麒, 张晓旭, 伍涛, 李先明, 涂俊凡, 杨夫臣, 刘政, 朱婷
【申请人】湖北省农业科学院果树茶叶研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年3月16日