对EGFRvIII有特异性的抗体结合位点的制作方法
【专利说明】对EGFRvI I I有特异性的抗体结合位点
[0001 ]本发明设及特异性结合EGFRvII I的结合蛋白和特异性结合EGFRvH I和CD3的多特 异性结合蛋白。本发明进一步延伸到结合EGFRWII和CD3的多特异性串联双抗体（tandem diabody)。特别是，本发明设及用于募集T细胞W专口有效地杀死几种类型实体瘤癌症的高 细胞毒性EGFRvII I/CD3双特异性串联双抗体(TandA b?)。
[0002] EGFR失调与许多癌症相关联，小分子和EGFR祀向抗体均已成功用于临床。然而，由 于EGFR的广泛的正常组织表达，被批准用于临床应用的抗体W及那些处于开发中的抗体均 具有严重的副作用。具有截短的胞外结构域并确保配体非依赖性固有活性的EGFR的缺失突 变体(deletion variantHiKEGFRWII)，是与致癌性转化相关的最常见的突变体形式。 EGFRvIII专口在癌组织中表达，并与各种实体瘤类型相关。癌细胞上受限制的EGFRvIII表 达提供了开发专口祀向癌症同时保护正常组织并充分降低与EGFR治疗相关的副作用的细 胞毒性抗体的机会。
[0003] 在本发明的第一个方面中，本文描述了全人的、高特异性的、高亲和力EGFRvin结 合蛋白。所描述的EGFRvIII结合蛋白具有如下优势：
[0004] 它们不促进或促进来自祀向阳性分子的细胞表面的非常低的EGFRvIII内化，运有 利于募集细胞毒性T-细胞或NK-细胞。图9中的结果显示，根据本发明，细胞在所有测试条件 下暴露于EGFRWII结合蛋白之后，相对于未处理的细胞，EGFRWII受体分子仍保留在细胞 表面上。运些结果表明，本发明的EGFRVIII/CD3结合蛋白令人惊讶地不显示任何内化趋势 (图9)。本发明的EGFRvIII特异性结合蛋白的结合可能抑制内化，而不是诱导内化，或者可 能促进EGFRvII I表达的增加，从而导致其细胞表面密度增加。
[000引可使用亲和力成熟技术(affinity maUiration technique)使运些高亲和力结合 蛋白的亲和力得到进一步大幅提高W获得对EGFRWII有特异性、Kd在l(K)pM范围或更低的 结合蛋白。令人惊讶的事实是，运些结合蛋白展示了结合EGFRvIII的异常特异性，且对天然 EGFR(野生型EGFR或EGFRwt)没有交叉反应性。由于来自EGFR细胞外结构域(外显子2-7)的 269个氨基酸的框内（in-打ame)缺失，因此相对于EGFRwt，在EGFRWII中形成新表位(neo- epitope)，且预计该新表位相当小：其由新的氨基酸并列(novel化xtaposition of amino acidsK氨基酸5融合于氨基酸274)和缺失位点处的一个新的GLY氨基酸组成。
[0006] 亲和力成熟筛选方法的目的在于通过促进解离速率化OFF)降低的结合蛋白的选择 来提高结合亲和力。然而，令人惊讶的是，所显示的亲和力成熟的结合蛋白大大增加了结合 速率化ON)，而koFF的降低对结合蛋白的提高达100倍的结合仅有小的贡献，其中一些可变抗 体结构域显示Kd小于lOOpM。
[0007] 运些独特的性质使运些本文所描述的对EGFRvIII有特异性的可变抗体结构域特 别适用于开发多特异性的，例如双特异性的、多价的、免疫效应细胞参与（immune effector cell engaging)、肿瘤祀向抗体治疗，诸如，例如EGFRvII I/CD3双特异性串联双抗体 (TandAb").
[0008] 在本发明的进一步方面中，提供了多价EGFRWII结合抗体，其对EGFRWII具有两 个结合位点，或在多价双特异性抗体的情况下，除对EGFRvHI具有两个结合位点之外，还对 T-细胞抗原CD3或特异性表达于天然杀伤(NK)细胞上的CD16A具有结合位点。
[0009] 在一个实施例中，使用对EGFRWII具有两个结合位点并另外包含对CD3具有两个 结合位点的EGFRvII I/CD3串联双抗体，并测试了它们与重组EGFRvII I-或EGFR-Fc融合抗原 的结合。在非还原条件下（由于完整的二硫键，分子结构仍部分保留），或在还原条件下（蛋 白结构完全变性），EGFRvIII-或EGFR-Fc融合抗原通过SDS-PAGE分离，通过蛋白质印迹 (Western Blotting)转移至PVDF膜，并使用不同的EGFRVIII/CD3串联双抗体抗体(diabody ant化ody)或EGFR-结合IgG西妥昔单抗来评估结合W修饰(decorate)印迹（图4)。该实施例 显示，包含对EGFRvIII具有两个结合位点的亲代EGFRvIII结合结构域和亲和力成熟的 EGFRvH I结合结构域在多价抗体形式中也保持其对EGFRvH I的选择特异性。在还原和非还 原条件下，所有EGFRWII/CD3串联双抗体均能识别EGFRvIII，但在任意的运些条件下均不 能识别全长野生型EGFR。该实施例还证明，本文所描述的EGFRWII特异性结合结构域能识 别线性表位，且其反应性不需要完整的Ξ维结构。运与EGFR-结合IgG抗体西妥昔单抗(爱必 妥化rbitux))相反，EGFR-结合IgG抗体西妥昔单抗能识别野生型EGFR和成熟的EGFRvIII， 但其反应性显然需要完整二硫键与构象表位(图4)。
[0010] 在另一个实施例中，使用包含与不同CD3结合结构域组合的亲代的或亲和力成熟 的EGFRvIII特异性结构域和/或在串联双抗体分子中具有不同顺序单个结合结构域的 EGFRvII I/CD3串联双抗体。具有结构域顺序Vl?3-VhEwkviiI-VlEwkviiI-Vh?3的串联双抗体在串 联双抗体分子的中部含有二价EGFRvIII结合位点，而具有结构域顺序VhEwkviiI-化?3-Vh?3- 化EGWviii的串联双抗体在外面的位置具有两个EGFRvIII结合位点且在中部具有两个CD3结 合位点。在ELISA中，分析串联双抗体的不同EGFRvIII-结构域和结构域顺序突变体与 EGFRvIII抗原、野生型EGFR抗原的浓度依赖性结合W及与CD3抗原的浓度依赖性结合（图 6)。所有含有亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的串联双抗体均显示了与EGFRvIII结合的 大幅提高，清楚地表现为相应的结合曲线向较低浓度移位大于两个数量级（图6)。没有观察 到任何串联双抗体与野生型EGFR抗原的结合。
[0011 ] 可通过隧菌体展示文库（phase display libraries)选择和鉴定抗EGFRWiUjt 体，例如选择性地结合成熟的而非天然形式(native form)的EGFR的抗原-结合蛋白。Τ细胞 是不能由天然抗体募集的有效的肿瘤杀伤效应细胞。因此，在本发明的进一步方面中，本发 明提供了一组多特异性EGFRVIII/CD3抗原-结合蛋白，特别是串联双抗体，其能募集Τ细胞、 具有宽范围的结合特性和细胞毒性特性。在一组体外试验中表征了本发明的抗原-结合蛋 白的结合特性、Τ细胞介导的细胞毒性活性和祀标介导的Τ细胞活化的特征。在FACS中，本发 明的抗原-结合蛋白对Biacore、ELISA和EGFRvIII-阳性细胞中的EGFRvIII抗原显示异常的 特异性。在测试的全浓度范围内，没有观察到任何结合蛋白与EGFR抗原或与EGFRwt表达细 胞的可检测的结合。最有效的高亲和力串联双抗体对表达EGFRvII I的F98神经胶质瘤细胞 和C册细胞显示EC50为IpM-lOpM的细胞毒性;剩余的串联双抗体显示EC50高达约lOOOOpM的 细胞毒性。也试验了运些串联双抗体对作为结合至天然形式的残基的更敏感探针的EGFRwt +细胞的细胞毒性。直至最大评估的串联双抗体浓度为0 .化Μ时，才在EGFRwt+细胞或其他 EGFRvIII-阴性细胞上观察到细胞毒性。与CD3的高亲和力结合对有效的T细胞募集是至关 重要的，然而，在体外不存在EGFRvIIr祀细胞时，如由增殖缺乏测量，本发明的串联双抗体 没有引起τ细胞活化，运有助于良好的临床前安全性（图10)。总之，抗肿瘤细胞毒性的严格 特异性和高效性由EGFRvII I/CD3串联双抗体介导。
[001引产生了具有CD3结合Kd范围为1. InM至约500nM但相对恒定的EGFRvin结合Kd(范围 为2. OnM-6.7nM)的串联双抗体，其显示了对表达EGFRvH I的细胞的CD3结合强度和细胞毒 性效力的良好相关性，其ECso值范围为25pM至约lOOOOpM(图11)。
[0013] 虽然本发明的抗原-结合蛋白对EGFRWII的亲和力已得到显著提高，但特异性没 有损失。
[0014] TandAb'^是用于表示串联双抗体的Affimed Therapeutics的商标化ipriyanov et al.,1999,J.Mol.Biol,293:41-56；Cochlovius et al.,2000,Cancer Res.,60:4336- 4341;Reusch et al.,2004,Int.J.化ncer,112:509-518,Kipriyanov,2009,Methods Mol Biol,562:177_93;McAleese and Eser,2012,Future Oncol.8:687-95)。在本发明的上下 文中，TandAb和串联双抗体作为同义词使用。
[0015] 野生型EGFR基因和蛋白的序列是已知的。EGFRvIII是野生型EGFR基因的外显子2- 7(8(Ubp)的框内缺失的结果，导致受体外部结构域的267个氨基酸缺失，并在外显子1和8的 接点处产生新的甘氨酸残基。EGFR胞外结构域内的该新的氨基酸并列产生肿瘤特异性和免 疫原性表位。
[0016] 根据本发明的第一个方面，描述了对至少EGFRWII具有特异性的结合蛋白，其不 与野生型EGFR交叉反应。该结合蛋白优选包括选自下表1A中所描述的CDR的抗体可变重链 的CDR1、CDR2、CDR3和抗体可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3。
[0017] 表1A:来自特异性结合EGFRWII的结合蛋白的人类轻链和重链CDR的氨基酸序列 的序列标识号 [001 引
[0019]
[0020] 因此，本发明的实施方案是具有至少一个EGFRWII结合位点的EGFRvIII结合蛋 白，包含抗体可变重链结构域和/或抗体可变轻链结构域;其中，所述抗体可变重链结构域 包含选自沈Q ID 側：27、33、42、46、49、53的〔〇1?1，选自沈01〇側：28、38、43、50、54、61、63 的〔032和沈9 10顯:29的〔01?;所述抗体可变轻链结构域包含选自569 10^:30、34、36、 39、44、47、51、56、59、64的〔01?1，选自沈9 10側：31、40、57的〔01?2和选自沈9 10側：32、35、 37、41、45、48、52、55、58、60、62和65的〔0尺3。
[0021] 根据进一步的实施方案，所述结合蛋白包含具有选自如表1B所示的SEQ ID N0:1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和25的抗体可变重链结构域和/或选自如表18所示的569 10 N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和26的抗体可变轻链结构域的至少一个EGFRvIII结合 位点。Ξ个可变轻链CDR和Ξ个可变重链CDR的氨基酸序列在表1中W粗体显示且加有下划 线。运些结构位点显示对EGFRvIII的亲和力提高，而特异性没有损失。运些抗原-结合蛋白 不与野生型EGFR抗原交叉反应。
[0022] 进一步地，本发明的运些抗原-结合蛋白在结合EGFRWII时没有显示或仅显示最 小化的EGFRvIII内化。根据本发明，在根据实施例9的测试条件下，在细胞暴露于EGFRvIII- 结合抗体之后，大于80%，优选大于90%，最优选大于95%的EGFRvin受体分子仍保留在细 胞表面。本发明的EGFRvin特异性结合蛋白的结合可能抑制内化，而不是诱导内化，或者可 能促进EGFRvII I的表达增加，从而导致其细胞表面密度增加。
[0023] 术语"结合蛋白"是指具有抗原结合性质的免疫球蛋白衍生物，即含有抗原结合位 点的免疫球蛋白多肤或其片段。该结合蛋白包含抗体的可变结构域或其片段。每个抗原-结 合结构域都由结合相同表位的抗体即免疫球蛋白、可变重链结构域(VH)和抗体可变轻链结 构域(VL)形成。本发明的可变轻链结构域或可变重链结构域是包含CDRUCDR2和CDR3的多 肤。优选地，本发明的结合蛋白缺乏免疫球蛋白恒定结构域。术语"结合蛋白"也指抗体片段 或衍生物，包括化b Jab '、F(ab '）2、Fv片段、单链Fv、双抗体、串联双抗体(TandAbK ；)、弹性 抗体 ^1姑16〇(17，胖003/025018)、串联单链尸￥((3。尸￥)2)。
[0024] 表1B:所有抗-EGFRvin可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)的氨基酸序 列（CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列W粗体显示且加有下划线）
[0025]
[0026]
[0027]
[0028] 在优选的实施方案中，赋予对EGFRWII具有特异性的结合蛋白包含来自表1所示 的可变重链结构域和可变轻链结构域的W下组合之一的抗原结合位点：
[0029] (i)沈Q ID N0:1 和沈Q ID N0:2，
[0030] 。1)沈9 10^):3和沈9 10^):4，
[0031 ] (iii)沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6，
[0032] (iv)沈Q ID N0:7和沈Q ID N0:8，
[0033] (V)沈Q ID N0:9和沈Q ID N0:10，
[0034] (vi)沈Q ID NO: 11和沈Q ID NO: 12，
[0035] (乂^)569 10^):13和沈9 10^):14，
[0036] (乂^1)沈9 10^):15和沈9 10^):16，
[0037] (ix)沈Q ID NO:17和沈Q ID NO: 18，
[003引（x)WQIDN0:l^PWQIDN0:20，
[0039] (xi)沈Q ID N0:21 和沈Q ID N0:22,或
[0040] (又11)56910^):25和沈910^):26。
[0041] 本发明还提供不仅对EGFRvIII具有特异性，而且还具有至少一个其他功能结构域 的结合蛋白。在进一步的实施方案中，所述至少一个其他功能结构域是效应子结构域 (effector domain)。"效应子结构域"是对效应细胞有特异性的结合位点，其可刺激或触发 细胞毒性、吞隧、抗原呈递、细胞因子释放。运样的效应细胞是，例如但不限于，T-细胞或NK- 细胞。特别是，所述其他效应子结构域包含形成CD3优选人类CD3的抗原结合位点的至少一 个抗体可变重链结构域和至少一个可变轻链结构域。
[0042] 因此，本发明的EGFRvIII结合蛋白可W是多特异性的。本文所用的术语"多特异性 的"意思是指本发明的结合蛋白对不同的表位具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个 用于EGFRvIII。例如，结合蛋白可W是Ξ特异性的，并且对肿瘤细胞上的两个不同的表位 和/或抗原具有结合位点且对效应细胞诸如例如CD3上的表位或抗原具有至少一个结合位 点。结合蛋白对相同抗原的不同表位和/或不同抗原的表位可具有结合位点。运样的多特异 性结合蛋白包括单链双抗体、（scFv)2、串联双抗体pTandAb?；)和弹性抗体（参见Le Gall et al.，1999F邸S Letts 453:164-168和WO 03/025018)。在本发明的具体实施方案中，结 合蛋白是对EGFRv III和CD3双特异性的。
[0043] 本发明的多特异性结合蛋白的CD3结合位点可由如下组成:如表2所示的可变重链 结构域(SEQ ID NO:23)和可变轻链结构域(SEQID NO:24)，或与CDR序列仅两个氨基酸不同 的该序列的密切同源物山1〇36 homolog)，或对CD3(称为CD3)有特异性的任何其他全人的、 人源化的或非人可变抗体结构域，诸如，例如，对CD3，特别是CD3e有特异性的可变抗体结构 域或任何其他全人的、人源化的或非人可变抗体结构域，诸如，例如UCHT1或0KT3的可变抗 体结构域。
[0044] 表2:全人抗-CD3可变重链结构域（VH)和可变轻链结构域（VL)的氨基酸序列 (CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列W粗体显示且加有下划线）
[0045]
[0046] 此外，本发明的EGFRWII结合蛋白可W是多价的。本文所用的术语"多价的"意思 是指，本发明的结合蛋白包含至少两个抗原结合位点。抗原结合位点可具有相同或不同的 特异性。在本发明的实施方案中，结合蛋白W至少两个结合位点即二价方式结合相同表位。 二价的结合蛋白的实例是双抗体，至少四价的结合蛋白的实例是串联双抗体。
[0047] 在本发明进一步的方面中，所述的EGFRWII结合蛋白W及双特异性EGFRWIKP CD3结合位点是人源化的或全人的，即人源的。在本发明进一步的方面中，EGFRvIII结合蛋 白或多特异性EGFRvIII和CD3结合蛋白是二聚体，即包含两个具有EGFRvIII和CD3抗原结合 位点的多肤。
[004引根据本发明，W串联双抗体(TandAb'K)的形式提供二聚双特异性EGFRWII和CD3 结合蛋白。运样的串联双抗体通过连接能够同源二聚的四个抗体可变结合结构域(单基因 构建体中的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)(参见McAleese and Eser ,2012， 化ture化col. 8:687-95))来构建。在运样的串联双抗体中，接头（1 inker)长度是其防止可 变结构域的分子间配对W致分子不能折叠回其本身上来形成单链双抗体，而是被迫与另一 条链的互补结构域(complementary domain)配对。对运些结构域还可W运样排列，即使得 相应的VH和化结构域在二聚期间配对。由单个基因构建表达后，两条同样的多肤链头尾折 叠形成约llOkDa的功能性非共价同源二聚体(McAleese and Eser,2012,Ρ\ι1:ι?Γθ Oncol.8: 687-95)。尽管不存在分子内共价键，同源二聚体一旦形成即是高度稳定的，保持完整并且 不恢复为单体形式。
[0049] 在多特异性串联双抗体的一个实施方案中，提供了人源化的双特异性四价抗体 (TandAb?)，其对CD巧蛇GFRvII I各具有两个结合位点巧GFRvII I/CD3 REC民Urr-TandAb、3 )，W利用T细胞的细胞毒性能力治疗成胶质细胞瘤(GB)、前列腺癌、头颈癌W及其他表皮生 长因子受体突变体VIII阳性化GFRVIII+)癌。
[0050