靶向整合的制作方法
【专利说明】祀向整合
[0001 ] 领域 本公开设及编码重组蛋白的序列至感兴趣的细胞中的祀向整合。具体而言，感兴趣的 细胞包含位于预定的基因组位置之内或邻近预定的基因组位置的外源核酸序列，其中所述 外源核酸序列包含至少一个识别序列，所述识别序列可被一种或更多种多核巧酸修饰酶利 用，用于编码重组蛋白的序列的祀向整合。
[0002] 背景 近年^在哺乳动物细胞的基因组之内的限定位置的重组蛋白表达构建物的祀向整合 (TI)已在生物制药行业中激发了很多兴趣。TI技术允许细胞系开发科学家将感兴趣的转基 因整合到预先限定的、表征良好的基因组位置中，由此使得重组蛋白表达特征的预测成为 可能，其可引起增加的细胞系稳定性、降低的克隆至克隆和分子至分子异质性，并大体降低 的细胞系开发时间轴。中国仓鼠卵巢(CH0)细胞是用于生物治疗蛋白生产的最常用的细胞 系。但是，尽管它们在治疗性蛋白生产中的公认的有用性，但是迄今为止，010细胞中的TI获 得有限的成功。因此，需要在CH0和其它细胞中实施TI的改善的方法，所述方法将有益于生 物生产行业。
[0003] 概述 在本公开的各种方面中，提供了分离的细胞，其包含位于基因组DNA中的至少一个外源 核酸序列，所述基因组DNA在表2中列举的至少一个基因组位置之内或邻近表2中列举的至 少一个基因组位置，其中各外源核酸序列包含用于多核巧酸修饰酶的至少一个识别序列。 在一个实施方式中，所述细胞是C册细胞。在另一实施方式中，所述至少一个识别序列包含 不内源存在于所述细胞(或C册细胞)的基因组中的核酸序列。在又一实施方式中，所述多核 巧酸修饰酶是祀向核酸内切酶(如锋指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、类转录激活因子效应 物核酸酶(TALENKCRIPSR核酸内切酶、I-TevI核酸酶或相关的单体杂合物，或人工祀向DNA 双链断裂诱导剂）、位点特异性重组酶(如λ整合酶、化e重组酶、FLP重组酶、丫-δ解离酶、Τη3 解离酶、OC31整合酶、Bxbl-整合酶或R4整合酶），或它们的组合。在又一实施方式中，第一 识别序列由第一ZFN对识别。在还一实施方式中，第一识别序列由第一ZFN对识别，且第二识 别序列由不同于第一ZFN对的第二ZFN对识别。在一次重复中，第一和第二ZFN对选自hSIRT、 hRSK4和hAAVSl。在还一实施方式中，外源核酸序列还包含至少一个选择性标记序列、至少 一个报道序列、至少一个调节控制序列元件或它们的组合。
[0004] 本公开的另一方面包括用于制备包含至少一个外源核酸序列的细胞的方法，所述 外源核酸序列包含至少一个用于多核巧酸修饰酶的识别序列。所述方法包括(a)将至少一 种祀向核酸内切酶引入细胞中，所述祀向核酸内切酶被祀向至在表2中列举的基因组位置 之内或邻近在表2中列举的基因组位置的序列；（b)将至少一种包含所述外源核酸的供体多 核巧酸引入细胞中，所述外源核酸侧接（i)与祀向基因组位置具有实质的序列同一性的序 列或（ii)祀向核酸内切酶的识别序列；和(C)在使得外源核酸被整合到细胞的基因组中的 条件下维持所述细胞。在一个实施方式中，所述细胞是CK)细胞。在另一实施方式中，通过同 源介导法将外源核酸整合到基因组中。在又一实施方式中，通过直接连接法将外源核酸整 合到基因组中。在还一实施方式中，祀向核酸内切酶选自锋指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、 类转录激活因子效应物核酸酶(TALENKCRIPSR核酸内切酶、I-TevI核酸酶或相关的单体杂 合物，和人工祀向DNA双链断裂诱导剂。
[000引本公开的又一方面提供了用于再祀向细胞供至少一种重组蛋白生产用的方法。所 述方法包括(a)提供包含至少一个用于多核巧酸修饰酶的外源识别序列的细胞，所述外源 识别序列位于至少一个在表2中列举的基因组位置之内或邻近至少一个在表2中列举的基 因组位置；（b)将（i)包含侧接第一和第二序列的编码重组蛋白的序列的至少一个表达构建 物，和（ii)识别细胞中的所述至少一个外源识别序列的至少一种多核巧酸修饰酶引入细胞 中；和(C)在使得编码重组蛋白的序列被整合到细胞的基因组中的条件下维持所述细胞。在 一个实施方式中，所述细胞是C册细胞。在另一实施方式中，所述细胞的至少一个外源识别 序列是祀向核酸内切酶识别位点;表达构建物的第一和第二序列是与靠近细胞中的外源识 别序列的染色体序列具有实质的序列同一性的序列;及所述至少一种多核巧酸修饰酶是祀 向核酸内切酶。在还一实施方式中，所述细胞的至少一个外源识别序列是祀向核酸内切酶 识别位点；表达构建物的第一和第二序列各自是祀向核酸内切酶的识别序列；及所述至少 一种多核巧酸修饰酶是祀向核酸内切酶。在一些实施方式中，祀向核酸内切酶是锋指核酸 酶（ZFN)、大范围核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN)、CRIPSR核酸内切酶、I- TevI核酸酶或相关的单体杂合物、或人工祀向DNA双链断裂诱导剂。在又一实施方式中，所 述细胞的至少一个外源识别序列是位点特异性重组酶识别位点;表达构建物的第一和第二 序列各自是位点特异性重组酶识别序列;及所述至少一种多核巧酸修饰酶是位点特异性重 组酶，其中所述位点特异性重组酶选自λ整合酶、化e重组酶、FLP重组酶、丫 -δ解离酶、Τη3解 离酶、OC31整合酶、Bxbl-整合酶和R4整合酶。在另外的实施方式中，将编码重组蛋白的序 列与至少一个表达控制序列可操作地连接。在替代的实施方式中，表达构建物还包含至少 一个选择性标记序列、至少一个报道序列、至少一个调节控制序列元件或它们的组合。在另 一实施例中，在用于至少一种重组蛋白的表达的条件下维持所述细胞。
[0006] 本公开的还一个方面包括用于再祀向细胞供重组蛋白生产用的试剂盒。所述试剂 盒包含细胞，所述细胞包含位于基因组DNA中的至少一个外源核酸序列，所述基因组DNA在 表2中列举的至少一个基因组位置之内或邻近在表2中列举的至少一个基因组位置，其中各 外源核酸序列包含至少一个用于多核巧酸修饰酶的识别序列，W及对应于识别序列的多核 巧酸修饰酶和用于编码感兴趣的重组蛋白的序列插入的构建物，其中所述构建物还包含一 对侧翼序列，所述侧翼序列对应于识别序列和/或侧接识别序列的基因组DNA。在一个实施 方式中，所述细胞是CH0细胞。在另一实施方式中，所述试剂盒还包含用于完成编码重组蛋 白的序列的祀向整合的说明书。在一些实施方式中，多核巧酸修饰酶是祀向核酸内切酶，其 选自锋指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、CRIPSR核酸 内切酶、I-TevI核酸酶或相关的单体杂合物，和人工祀向DNA双链断裂诱导剂。在其它的实 施方式中，多核巧酸修饰酶是位点特异性重组酶，其选自λ整合酶、Cre重组酶、FLP重组酶、 丫 -S解离酶、Τη3解离酶、OC31整合酶、Bxbl-整合酶和R4整合酶。
[0007] 本公开其它的方面和重复如下详述。
[000引 附图简述 图1是用于将人AAVS1ZFN识别序列整合到CH0基因组位置参考序列ID NW_ 003618207.1，碱基对5366-20679中的供体质粒的示意图。
[0009] 图2是含有整合的AAVS着陆区（landing pad)的参考序列ID NW_003618207.1，碱 基对5366-20679示意图。表明了用于接头PCR的引物结合位点。
[0010] 图3是两种不同的一般供体设计的示意图，可通过ZFN介导的祀向整合使用所述设 计将重组蛋白表达构建物引入基因组中。（A)欲整合的所需序列，包含，例如，重组蛋白表达 构建物(一种或更多种），（本文称作"有效负载"序列），所述欲整合的所需序列侧接与围绕 ZFN识别序列的基因组DNA序列同源的序列。该设计将允许经由经典的同源重组的祀向整 合。（B)所述有效负载侧接与在宿主细胞基因组中被祀向的那种相同的ZFN识别序列。因此， 一旦使用ZFN对进行转染，ZFN将切割内源基因组DNA W及供体DNA二者，留下黏性末端 (sticky cohesive ends)，所述黏性末端将允许有效负载经由DNA修复机制的祀向整合。在 两种设计中，有效负载可包括用于感兴趣的重组蛋白的表达盒W及用于选择性标记的表达 盒。有效负载中的其它元件可包括报道分子、启动子或任何其它的外源序列。
[0011] 详述 编码蛋白，特别是生物治疗蛋白产物的序列的祀向整合对于所需基因材料的渗入 效率，W及对于整合之后的蛋白表达的改善的稳定性、均一性和水平而言，均强烈地优于随 机整合。核酸内切酶技术，例如锋指核酸酶(ZFN)技术W及本文讨论的其它技术，目前允许 内源基因组序列的位点特异性的修饰的引入，运比使用祀向整合的某些现有方法具有对于 定制的更高的效率和更大的机会。本公开提供了用于编码重组蛋白的序列的祀向整合的细 胞，其中由于"着陆区"位点在它们的基因组中的渗入，细胞是特别合适的。可如本文所述对 中国仓鼠卵巢(C册)细胞或其它哺乳动物细胞进行修饰，W接受此类着陆区，即修饰W包括 合成核巧酸序列，所述合成核巧酸序列包含一个或更多个用于多核巧酸修饰酶，例如位点 特异性重组酶和/或祀向核酸内切酶的识别序列。可在用于重组蛋白（一种或更多种）的表 达的合适的位置插入所述着陆区。着陆区（包含一个或更多个用于多核巧酸修饰酶的识别 序列的序列)在基因组内的特定位置整合之后，可使用对应的重组酶和/或祀向核酸内切酶 在含有一个或更多个识别序列的位置插入编码一种或更多种蛋白的序列，且此类插入W高 于随机整合或其它前述方法的效率水平发生。将理解多重着陆区可位于基因组中的不同位 置，运允许重组蛋白表达构建物或盒W及多个独特蛋白表达盒的多拷贝整合。
[0012] I.包含至少一个识别序列的外源序列 一方面，本公开包括外源核酸序列（即着陆区），其包含用于至少一种多核巧酸修饰酶 的至少一个识别序列，所述多核巧酸修饰酶例如位点特异性重组酶和/或祀向核酸内切酶。 位点特异性重组酶在本领域中是众所周知的，且一般可将其称作转化酶、解离酶或整合酶。 位点特异性重组酶的非限制性实例可包括λ整合酶、Cre重组酶、FLP重组酶、丫 -δ解离酶、 Τη3解离酶、ΦC31整合酶、Bxbl-整合酶和R4整合酶。位点特异性重组酶识别特异性识别序 列（或识别位点）或其变体，上述所有在本领域中都是众所周知的。例如，Cre重组酶识别 LoxP位点，及FLP重组酶识别FRT位点。
[0013] 考虑的祀向核酸内切酶包括锋指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、类转录激活因子效 应物核酸酶(TALEN)、CRIPSR/化S样核酸内切酶、I-TeW核酸酶或相关的单体杂合物，或人 工祀向DNA双链断裂诱导剂。下文进一步描述运些祀向核酸内切酶的每一个。例如，典型地， 锋指核酸酶包含DNA结合结构域（即锋指)和剪切结构域（即核酸酶），上述二者在下文进行 描述。多核巧酸修饰酶的定义中还包括本领域技术人员已知的任何其它有用的融合蛋白， 例如可包含DNA结合结构域和核酸酶。
[0014] 着陆区序列是包含至少一个识别序列的核巧酸序列，所述识别序列由特异性多核 巧酸修饰酶，例如位点特异性重组酶和/或祀向核酸内切酶选择性结合并修饰。一般而言， 着陆区序列中的识别序列（一个或更多个)不内源存在于欲修饰的细胞的基因组中。例如， 在欲修饰的细胞是CH0细胞的情况下，着陆区序列中的识别序列不存在于内源CH0基因组 中。可通过选择不内源存在于祀向细胞的基因组内的用于高效率核巧酸修饰酶的识别序列 来改善祀向整合的速率。不内源存在的识别序列的选择还减少了可能的脱祀(off-target) 整合。在其它方面，天然存在于欲修饰的细胞中的识别序列的使用可能是合意的。例如，在 着陆区序列中采用多个识别序列的情况下，一个或更多个可为外源的，而一个或更多个可 为天然的。
[0015] 本领域普通技术人员可容易地确定由位点特异性重组酶和/或祀向核酸内切酶结 合并切割的序列。在下表1中提供巧巾示例性ZFN识别序列。
[0016] 表1.ZFN识别序列
曰'
[0017] 多个识别序列可存在于单一着陆区中，允许通过两种或更多种多核巧酸修饰酶相 继地祀向着陆区，W使得可插入两个或更多个独特有效负载序列(除其它W外，包含蛋白表 达盒）。或者，多个识别序列在着陆区中的存在允许相同的有效负载序列的多拷贝被插入到 着陆区中。当两个有效负载序列被祀向到单一着陆区时，着陆区包括用于第一多核巧酸修 饰酶的第一识别序列(例如第一 ZFN对），和用于第二多核巧酸酶的第二识别序列(例如第二 ZFN对）。或者，或另外，可在细胞的基因组之内的多个位置整合包含一个或更多个识别序列 的单个着陆区，W允许包含重组蛋白表达构建物的有效负载序列的多拷贝整合。可在使用 包含表达构建物的有效负载序列的多拷贝进行转化的细胞中观察增加的蛋白表达。或者， 当插入包含不同的表达盒的多个独特有效负载序列时，无论是在相同还是不同的着陆区 中，均可同时表达多种蛋白产物。不管有效负载序列的数量和类型，当祀向核酸内切酶是 ZFN时，示例性ZFN对包括hSIRT、hRSK4和hAAVSl，补充的识别序列如上表1中鉴定。
[0018] -般而言，用作着陆区的外源核酸可包含至少一个识别序列。例如，外源核酸可包 含至少一个、至少两个、至少Ξ个、至少四个、至少五个、至少六个、至少屯个、至少八个、至 少九个或至少十个或更多个识别序列。在包含多于一个识别序列的实施方式中，识别序列 可彼此之间独特（即由不同的多核巧酸修饰酶识别），可为相同的重复序列，或可为重复序 列和独特序列的组合。
[0019] 本领域普通技术人员将容易地理解，除了识别序列（一个或更多个)之外，用作着 陆区的外源核酸也可包括其它序列。例如，包括一个或更多个编码选择性标记的序列可能 是有利的，所述选择性标记例如抗生素抗性基因、代谢选择标记或巧光蛋白。也可存在其它 补充序列，例如转录调节和控制元件（即启动子、部分启动子、启动子包载、起始密码子、增 强子、内含子、绝缘子和其它表达元件）的使用。
[0020] 除了适当的识别序列(一个或更多个)的选择之外，具有高切割效率的祀向核酸内 切酶的选择也改善着陆区（一个或更多个)的祀向整合的速率。可使用本领域众所周知的方 法测定祀向核酸内切酶的切割效率，包括，例如，使用例如CEkl测定或在PCR扩增子中的插 入/缺失(插入/缺失（Indel))的直接测序的测定。
[0021] 可改变并将改变用在本文所公开的方法和细胞中的祀向核酸内切酶的类型。祀向 核酸内切酶可为天然存在的蛋白或人工改造的蛋白。祀向核酸内切酶的一个实例是锋指核 酸酶，其在下文被进一步详细讨论。
[0022] 可使用的祀向核酸内切酶的另一实例是包含至少一种核定位信号的RNA指导的核 酸内切酶，其允许核酸内切酶进入真核细胞的核中。RNA指导的核酸内切酶还包含至少一个 核酸酶结构域和至少一个与指导RNA相互作用的结构域。通过指导RNA将RNA指导的核酸内 切酶导向至特异性染色体序列，W使得RNA指导的核酸内切酶剪切该特异性染色体序列。因 为指导RNA为祀向剪切提供特异性，所WRNA指导的核酸内切酶的核酸内切酶是通用的，并 可与不同的指导RNA-起使用，W剪切不同的祀染色体序列。下文进一步详细讨论的是示例 性RNA指导的核酸内切酶蛋白。例如，RNA指导的核酸内切酶可为CRISPR/化S蛋白或CRISPR/ Cas样融合蛋白、源自成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPRVCRISPR相关(Cas)系统 的RNA指导的核酸内切酶。
[0023] 祀向核酸内切酶也可为大范围核酸酶。大范围核酸酶是由大识别位点，即一般在 约12对碱基对至约40对碱基对范围内的识别位点表征的限制性核酸内切酶。由于该要求， 该识别位点在任何给定的基因组中一般仅出现一次。在大范围核酸酶中，名为LAGLIDADG的 归巢核酸内切酶家族已成为用于基因组和基因组工程的研究的有价值的工具。可通过使用 本领域技术人员众所周知的技术来修饰它们的识别序列而使大范围核酸酶祀向特异性染 色体序列。参见，例如，Epinat 等人，2003，Nuc. Acid Res. ,31(11) :2952-62 和 Stoddard, 2005,如arterly Review of Bio地ysics,第1-47页。
[0024] 可使用的祀向核酸内切酶的另一实例是类转录激活因子效应物(TALE)核酸酶。 TAL